Email this article 
Significance of Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinases Expression in Pathogenesis and Differential Diagnosis of Periodontal Pathology
- Authors: Kazeko L.A.1, Zakharava V.A.2, Benesh J.D.1, Cherstvoy E.D.1
-
Affiliations:
- Belarusian State Medical University
- N.N. Alexandrov National Cancer Centre of Belarus
- Issue: Vol 78, No 3 (2023)
- Pages: 213-226
- Section: STOMATOLOGY: CURRENT ISSUES
- Published: 03.07.2023
- URL: https://vestnikramn.spr-journal.ru/jour/article/view/2041
- DOI: https://doi.org/10.15690/vramn2041
- ID: 2041
Cite item
Full Text
Abstract
Background. The balance of metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMPs) is crucial for the manifestation and progression of periodontal diseases and is one of the promising areas of scientific research in terms of developing methods for selective inhibition of MMPs. Aims — to determine the significance of TIMP1 and TIMP2 expression parameters in gingival biopsies to identify the type of periodontitis at the stage of disease manifestation. Methods. A prospective study with parallel inclusion of patients with different forms of periodontitis in the compared groups was performed. The object of this study were patients with various forms of periodontitis. Pathological examination with morphometric analysis of TIMPs expression and subsequent statistical data analysis was performed using AperioImageScope v12.4.0.5043, Statistica 10.0, MedCalc19.6. Results. The study included 67 patients with aggressive (AgP, Grade C, n = 19), chronic simplex (CSP, Grade В, n = 10) and chronic complex (CCP, in the presence of occlusal trauma, Grade В, n = 38) periodontitis and 15 conditionally healthy patients (control group). The expression of TIMP1 and TIMP2 was detected with variable intensity both in the epithelium and in the stroma of the gingiva, and was significantly higher in periodontitis groups compared with the control group (MeTIMP1/2 = 32%/70%). Parameters of TIMP1 and TIMP2 expression had no significant differences in the groups with AgP (MeTIMP1/2 = 84%/98%) and CCP (MeTIMP1/2 = 83%/94%), except for higher parameters of the positivity of epithelial expression of TIMP2 (U = 61 372; p < 0.05) and lower levels of intensity of its expression in AgP (MeAgP/CCP=180/171; U = 56 491; p < 0.001). Correlation analysis revealed an inverse relationship of TIMPs expression parameters with those MMPs, including those most significant for the development of AgP — MMP1 (ρ = –0.40), MMP8 (ρ = –0.34), and MMP14 (ρ = –0.24). ROC analysis established acceptable informativeness of all studied parameters of total expression and positivity of epithelial expression of TIMP1, as well as positivity of total expression and intensity of epithelial expression of TIMP2 to distinguish between aggressive and chronic forms of periodontitis at the stage of disease manifestation. Conclusion. Our results show an increase in the expression of TIMP1 and TIMP2 in various forms of periodontitis and an inverse relationship with the MMPs inhibited by them. This complements both the fundamental knowledge of the development and progression of periodontal pathology and may have applied significance in terms of using the studied TIMP1 and TIMP2 expression criteria to establish the aggressive course of periodontitis already at the stage of disease manifestation, which will allow to individualize treatment, prevent or slow down tooth loss in order to preserve and/or improve the quality of life of this patient group.
Full Text
Обоснование
Основная роль в деградации соединительной ткани и альвеолярного отростка кости при парадонтите принадлежит активированным ферментам клеток-хозяев [1], среди которых наиболее значимую группу представляют матриксные металлопротеиназы (ММРs). Выделяют два основных пути регуляции активности ММРs: протеолитическую активацию неактивных ферментов (pro-ММР) и взаимодействие с ингибиторами матриксных металлопротеиназ (TIMPs).
ТIМРs представляют собой тканеспецифические эндогенные ингибиторы ММРs, дезинтегрина и металлопротеиназ с мотивами тромбоспондина (ADAMTS) [2], которые образуют прочные нековалентные комплексы с активным центром ММРs и снижают их активность в соотношении 1:1 [3]. ТIМРs объединены в семейство, состоящее из четырех гомогенных ферментов с приблизительно сопоставимым потенциалом [3–5]. В последовательности генов всех четырех ТIМРs не выявлено большого сходства, что свидетельствует об уникальной биологической роли каждого из них. Все TIMPs представлены двумя доменами, связанными между собой шестью дисульфидными связями: малым C-концевым и большим N-концевым, представляющим собой остаток Cys, который связывается с активным Zn2+-связывающим центром MMP в эквимолярном соотношении, вследствие чего и наблюдается ингибирование. С-концевой домен задействован в активации pro-MMP [3, 6].
TIMP1 впервые был выделен на культуре человеческих фибробластов. TIMP1 связывается с неактивным pro-MMP9, образуя комплекс, в котором TIMP1 сохраняет способность ингибировать активность другого активного MMP через его N-концевой домен [7]. TIMP1 широко синтезируется многими клетками и тканями организма, а транскрипция гена TIMP1 индуцируется провоспалительными цитокинами (IL-1, IL-6, OSM, LIF и TNF-α), TGF-β [7, 8]. TIМР1 играет важную роль в активации незрелых клеток пульпы для нормального дентиногенеза, его экспрессия повышается при воспалении и онкогенезе.
TIMP2 был впервые обнаружен при разработке техники обратной зимографии [9]. Y. De Clerсk et al. [10] выделили этот белок из бычьей эндотелиальной клеточной культуры. TIMP2 ингибирует все MMPs, однако наиболее сильное ингибирующее действие он оказывает на MMP8 [11].
В 1990 г. N. Pavloff et al. идентифицировали TIMP3 [12]. Клоны TIMP3 человека и мыши были секвенированы S. Apte et al. в 1992 г. [13]. TIMP3 является уникальным среди TIMPs млекопитающих по ингибированию более широкого ряда MMPs, включая несколько членов семейств ADAM и ADAMTS [9].
TIMP4 впервые был идентифицирован при клонировании [14], мРНК обнаружена в тканях сердца, в более низких концентрациях — в почках, плаценте, толстой кишке. TIMP4 сопоставим с TIMP2 в его способности связываться с pro-MMP2 [15] и способен ингибировать ММР1, 2, 3, 7, 9.
Все TIMPs не специфичны и способны ингибировать все известные MMPs, хотя наблюдается определенная предпочтительность связывания (табл. 1) [16].
Таблица 1. Предпочтительное ингибирование MMPs известными TIMPs
MMPs | TIMPs | Источник [16] |
MMP1 | TIMP4 | Radomski et al. (2002) |
MMP2 | TIMP2, TIMP3, TIMP4 | Chowdhury et al. (2015); Suomela et al. (2001); Radomski et al. (2002) |
MMP7 | TIMP1, TIMP4 | Bourboulia, Stetler-Stevenson (2010); Radomski et al. (2002) |
MMP8 | TIMP1 | Hästbacka et al. (2015) |
MMP9 | TIMP1, TIMP3, TIMP4 | Mittal et al. (2016); Suomela et al. (2001); Radomski et al. (2002) |
MMP12 | TIMP1 | Suomela, et al. (2001) |
MMP13 | TIMP3 | Suomela, et al. (2001) |
MMP14 | TIMP2, TIMP4 | Itoh (2015); Radomski, et al. (2002) |
Разрушение пародонтальной связки и альвеолярной кости при пародонтите отражает относительную сверхэкспрессию MMPs по отношению к TIMPs и может быть уменьшено при восстановлении этого баланса. Показано, что ингибирование экспрессии или активности MMPs или увеличение экспрессии TIMPs может снизить скорость разрушения тканей при пародонтите [17]. Согласно данным Е. Mouzakiti et al. [18], на фоне лечения пародонтита значительно увеличивалась экспрессия TIMP1 и уменьшилось соотношение MMPs/TIMP1. Экспрессия TIMP1 у пациентов с болезнями пародонта сразу после лечения была выше таковой у здоровых пациентов [18], и уровни TIМР1, TIMP2 постепенно снижались после терапии болезней пародонта [19].
Научными исследованиями доказано, что TIMP1, 2 и 3 участвуют в формировании эмбриональной кости [20, 21], а TIMP1 и 2 [22] — и в постнатальном развитии костей. Установлено, что остеобласты и остеоциты экспрессируют TIMP1, 2 и 3 [20–22]. Согласно данным K. Hatori et al. [23], MMPs и TIMPs могут играть ключевую роль в постнатальном аппозиционном формировании кости и созревании костного матрикса посредством ремоделирования молекул внеклеточного матрикса. Дальнейшее изучение этого вопроса актуально для понимания биологической интеграции искусственного материала с костью для клинических целей, например восстановления костных дефектов искусственными заменителями, в том числе при патологии пародонта и установке дентальных имплантатов.
Баланс MMPs и TIMPs имеет решающее значение для разрушения соединительнотканного матрикса как при физиологических, так и при патологических состояниях. Поэтому по-прежнему сохраняет актуальность изучение взаимосвязи между MMPs и TIMPs как отражение особенностей течения и прогрессирования заболеваний пародонта. Дальнейшие научные исследования по разработке способов регулирования активности ферментов с селективным ингибирующим действием на ММРs и других членов семейства металлопротеиназ [6] могут помочь предупредить или замедлить частичную или полную потерю зубов и сохранить качество жизни пациентов с патологией пародонта.
Цель исследования — установить значение параметров экспрессии TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десны для определения характера течения пародонтита на этапе манифестации заболевания.
Методы
Дизайн исследования
Проведено проспективное исследование с параллельным включением в сравниваемые группы пациентов с различными формами пародонтита.
Критерии соответствия
При формировании групп исследования использовались критерии классификаций пародонтитов, приведенные в табл. 2.
Таблица 2. Международные и региональные классификации пародонтитов, действующие в период формирования групп и проведения исследования
1999 Classification of Periodontitis | Клиническая классификация (региональная) 2002–2019 | МКБ-10 | 2018 AAP Periodontal Classification |
Chronic periodontitis | Хронический периодонтит (К05.3): сложный (с деструкцией периодонтальной связки и межальвеолярной кости с наличием вертикальной резорбции и окклюзионной травмы); простой (с деструкцией периодонтальной связки и межальвеолярной кости с наличием горизонтальной резорбции) | К05.3 Хронический пародонтит: БДУ; сложный; простой | Periodontitis Grade В |
Aggressive periodontitis | Быстропрогрессирующий периодонтит (К05.4) | В МКБ-10 форма быстропрогрессирующего пародонтита взрослых ошибочно не учтена | Periodontitis Grade C |
Критерии включения:
- наличие быстропрогрессирующего (БПП, грейд С), хронического простого (ХПП, грейд В) и сложного (ХСП с окклюзионной травмой, грейд В) пародонтита;
- возраст — 18–60 лет (18–35 лет — для быстропрогрессирующего, 36–60 лет — для хронического простого и сложного пародонтита);
- лица мужского и женского пола;
- информированное согласие пациентов для проведения исследования.
Критерии исключения:
- отказ пациента от исследования;
- возраст пациентов до 18 лет и старше 60 лет;
- беременность или лактация (женщины);
- медицинский или психиатрический риск, нарушающий получение анамнестической информации;
- наличие острого инфекционного процесса челюстно-лицевой области;
- наличие тяжелой сопутствующей соматической и инфекционной патологии;
- остеопороз и хронические заболевания, связанные с риском его развития;
- прием медикаментов, влияющих на минеральную плотность костной ткани (при подозрении на быстропрогрессирующее течение пародонтита).
Условия проведения
Клинико-инструментальное исследование и обследование пациентов с использованием лучевых методов диагностики проведено на 1-й кафедре терапевтической стоматологии УО «Белорусский государственный медицинский университет» на базе ГУ «Республиканская клиническая стоматологическая поликлиника» и включало: оценку гигиены полости рта (OHI-S), тяжести воспаления десны (GI); определение глубины зондирования пародонтальных карманов и утери прикрепления (LA), рецессии десны, поражения фуркации, патологической миграции зубов, их подвижности, наличия окклюзионной травмы с регистрацией всех результатов обследования в пародонтальной карте; выполнение общего и биохимического анализа крови, анализа крови на тиреоидные гормоны и остеоденситометрии для исключения соматической патологии, влияющей на состояние пародонта; обследование с применением методов лучевой диагностики (панорамной рентгенографии или компьютерной томографии) для оценки уровня и характера резорбции костной ткани. Морфологический раздел выполнен на базе кафедры патологической анатомии УО «Белорусский государственный медицинский университет».
Продолжительность исследования
Исследовался биопсийный материал десен пациентов с патологией пародонта, обратившихся за медицинской помощью в период 2018–2020 гг.
Описание медицинского вмешательства
Полость рта в области поражения и планируемой биопсии обрабатывалась антисептическим лекарственным средством с проведением инфильтрационной анестезии. Далее выполнялся кюретаж пародонтальных карманов с взятием инцизионной биопсии краевой десны в области медиального или дистального сосочков в участках максимального клинически определяемого поражения пародонта, включая боковую стенку пародонтального кармана, с использованием острых хирургических ножниц или скальпеля малого брюшистого № 15. Оптимальный размер биоптата не должен был быть менее 1,5 мм в толщину и 2–3 мм в высоту. Иссеченный участок десны переносился на полоску фильтровальной бумаги размером 2,0 × 5,0 см, которая складывалась в 3–4 слоя и перевязывалась 2–3 узлами шовного материала для удержания биоптата в расправленном состоянии с целью исключения его пространственной деформации и получения правильно ориентированных срезов для патогистологического исследования с погружением биопсийного материала в емкость с 10%-м раствором нейтрального формалина. Послеоперационная рана промывалась антисептическим лекарственным средством с последующим гемостазом компрессией и контрольным осмотром на следующий день.
Исходы исследования
Определение параметров экспрессии TIMP1 и TIMP2 с использованием программы AperioImageScope в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита:
- позитивность (Positivity) — отношение числа позитивных пикселей к общему числу позитивных и негативных пикселей × 100%;
- доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью (Nsr+p) — отношение числа позитивных пикселей с высокой и умеренной интенсивностью к общему числу позитивных и негативных пикселей × 100%;
- индекс интенсивности в иммунопозитивных участках (TIMPs_index) — отношение суммы интенсивностей пикселей с высокой, средней и низкой интенсивностью к числу позитивных пикселей;
- общий индекс интенсивности ИГХ-реакции (TIMPs_INDEX) — отношение суммы интенсивностей негативных и позитивных пикселей к общему числу позитивных и негативных пикселей.
Методы регистрации исходов
Биопсийный материал десен дегидратировался в спиртах восходящей концентрации при помощи тканевого процессора, заключался в парафин с ориентацией плоскости биопсийного среза перпендикулярно плоскости среза парафинового блока с использованием заливочного центра с наличием «холодной точки» для правильной его ориентации. Из блоков изготавливались гистологические срезы толщиной 2,5 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином и заключались в «канадский бальзам» или аналогичную среду, покрывались покровным стеклом.
Оценке подлежали выраженность и состав воспалительной инфильтрации в сосочковом и сетчатом слоях десны, наличие межэпителиальных лейкоцитов, наличие некроза или гипертрофии коллагеновых волокон, кровоизлияний, наличие и характер дистрофии в эпителиальном компоненте десны, ее эрозирование, десквамация эпителия, акантоз.
С парафиновых блоков наиболее информативных гистологических препаратов изготавливались срезы толщиной 2,5 мкм, которые после депарафинизации окрашивались с использованием иммуногистохимического метода (ИГХМ). Протоколы иммуногистохимического окрашивания с моноклональными антителами к TIMP1 и TIMP2 и характеристика выявленной экспрессии указаны в табл. 3.
Таблица 3. Ключевые особенности иммуногистохимического метода для выявления TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита
Первичное антитело | TIMP1 | TIMP2 |
Происхождение антител | Rabbit | Mouse |
Демаскировочный буфер, рН | pH = 9,0 125o 2’30’’ | pH = 9,0 125o 2’30’’ |
Разведение | 1:50 | 1:800 |
Время экспозиции хромогена, мин | 4 | 5 |
Позитивный контроль | Предстательная железа | Почка |
Характер экспрессии | Гомогенное цитоплазматическое и мембранное окрашивание в коричневый цвет различной интенсивности лейкоцитов/гистиоцитов, эпителия десны, фибробластов, эндотелиоцитов (TIMP2) | |
В последующем выполнялось сканирование иммуногистохимических препаратов цифровым слайд-сканером MoticEasyScan с анализом полученных изображений при помощи AperioImageScope v. 12.4.0.5043. Проводилось выделение 9 случайных непересекающихся полей зрения (цифровое увеличение — ×20) с анализом иммуногистохимического окрашивания отдельно в эпителиальном и стромальном компоненте десны, а также полей, включающих в равной пропорции как эпителиальный, так и стромальный компонент (по 3 поля зрения). В рамках программного анализа экспрессии TIMPs в ткани десны интенсивность продуктов реакции диаминбензидина измерялась AperioImageScope автоматически и разделялась на три уровня интенсивности и негативную реакцию. Результат программной оценки параметров позитивности и доли пикселей с высокой и умеренной экспрессией имел прямую взаимосвязь, а интенсивность экспрессии — обратную взаимосвязь с данными визуальной оценки.
Этическая экспертиза
Этическая экспертиза проведена на заседании комитета по биомедицинской этике Белорусского государственного медицинского университета (протокол № 13 от 28 июня 2018 г.) с одобрением плана проведения и дизайна настоящего исследования и необходимости получения информированного согласия на обследование и лечение от каждого тематического пациента.
Статистический анализ
Принципы расчета размера выборки. Размер выборки предварительно не рассчитывался, а определялся количеством пациентов, соответствующих установленным критериям включения и исключения.
Методы статистического анализа данных. Статистический анализ данных проводился с использованием программного обеспечения Statistica 10.0, MedCalc 19.6. Поскольку распределение данных с использованием критерия Шапиро–Уилка (W) в некоторых из групп отличалось от нормального, для анализа данных применены методы непараметрической статистики с вычислением медианы (Ме), интерквартильного (IQR) и 95%-го доверительного интервалов, максимального и минимального значений. Сравнение независимых выборок по количественным признакам осуществляли с использованием дисперсионного анализа непараметрических данных ANOVA и определением критериев Краскела–Уоллиса (Н), Манна–Уитни (U-критерий) и хи-квадрат (χ2). Анализ взаимосвязи исследуемых параметров выполнен с использованием критерия Спирмена (ρ). С целью решения задачи классификации пародонтитов и оценки ее диагностической эффективности выполнен ROC-анализ с определением пороговых значений и их операционных характеристик — диагностической чувствительности (ДЧ) и специфичности (ДС).
Результаты
Объекты (участники) исследования
Объектом исследования явились 67 пациентов с быстропрогрессирующим (грейд С, n = 19), хроническим простым (грейд В, n = 10) и хроническим сложным (при наличии окклюзионной травмы, грейд В, n = 38) пародонтитом и 15 условно здоровых пациентов (предимплантационные биопсии — группа контроля), которым было проведено клинико-инструментальное обследование и лечение с получением у каждого пациента информированного согласия. Патогистологическое исследование биопсийного материала десен пациентов с различными формами пародонтита не выявило статистически значимых различий между исследуемыми группами по оцениваемым признакам дистрофических изменений эпителия и собственной пластинки десны, состоянию коллагеновых волокон, наличию кровоизлияний, выраженности и составу воспалительной инфильтрации. Группы исследования были также сопоставимы по основным клинико-рентгенологическим параметрам за исключением данных панорамной и/или компьютерной томографии, при которой в группах быстропрогрессирующего и хронического сложного пародонтита статистически значимо чаще выявлялась вертикальная резорбция костной ткани I–II степени (р ≤ 0,005), а в группе хронического простого пародонтита преобладала горизонтальная резорбция I–II степени (р ≤ 0,05) (табл. 4).
Таблица 4. Общая клинико-рентгенологическая характеристика обследуемых групп пациентов с патологией пародонта
Признак* | БПП1, грейд С | ХПП2, грейд В | ХСП3, грейд В | p (χ2) |
Число пациентов | 19/67 (28) | 10/67 (15) | 38/67 (57) | |
Клинические признаки | ||||
Пародонтальные карманы, мм: • 4–5 • ≥ 6 | 12/19 (63) 7/19 (37) | 6/10 (60) 4/10 (40) | 25/38 (66) 13/38 (34) | NA NA |
Утеря прикрепления: • LA I • LA II | 13/19 (68) 6/19 (32) | 6/10 (60) 4/10 (40) | 26/38 (68) 12/38 (32) | NA NA |
Рецессия десны | 10/19 (53) | 6/10 (60) | 23/38 (61) | NA |
Поражение фуркации I–II степени | 3/19 (16) | 2/10 (20) | 7/38 (18) | NA |
Подвижность зубов I–II степени | 2/19 (11) | 1/10 (10) | 5/38 (13) | NA |
Данные панорамной рентгенографии и/или компьютерной томографии | ||||
Резорбция костной ткани I–II степени: • горизонтальная • вертикальная | 5/19 (26) 13/19 (68) | 7/10 (70) 1/10 (10) | 8/38 (21) 28/38 (74) | p1–2 = 0,046 p2–3 = 0,006 p1-2 = 0,005 p2–3 = 0,0004 |
Примечание. БПП — быстропрогрессирующий пародонтит; ХПП — хронический простой пародонтит; ХСП — хронический сложный пародонтит; * — показатели (номинативные данные — абсолютные числа и доли, %).
Основные результаты исследования
Экспрессия TIMP1 и TIMP2 выявлялась с вариабельной позитивностью и интенсивностью в как в эпителии, так и в строме десны при различных формах пародонтита и в группе предимплантационных биопсий (рис. 1, 2, табл. 5).
Рис. 1. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к TIMP1 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита (×200) (хромоген — DAB, контроокрашивание гематоксилином Майера) и результат работы алгоритма positive pixel count программы AperioImageScope: БПП — быстропрогрессирующий пародонтит; ХСП — хронический сложный пародонтит; ХПП — хронический простой пародонтит
Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита (×200) (хромоген — DAB, контроокрашивание гематоксилином Майера) и результат работы алгоритма positive pixel count программы AperioImageScope: БПП — быстропрогрессирующий пародонтит; ХСП — хронический сложный пародонтит; ХПП — хронический простой пародонтит
Имела место тенденция к повышению позитивности и интенсивности эпителиальной экспрессии TIMP1, а также интенсивности стромальной экспрессии данного маркера в направлении от предимплантационных биопсий (группы контроля) к хроническому простому пародонтиту (грейд В) с наибольшей экспрессией данного маркера в группах быстропрогрессирующего (грейд С) и хронического сложного (грейд В) пародонтита. Параметры общей экспрессии, а также позитивности стромальной экспрессии TIMP1 не имели отличий в группах контроля и хронического простого пародонтита (грейд В) и статистически значимо возрастали в группах быстропрогрессирующего (грейд С) и хронического сложного (грейд В) пародонтита. Характер экспрессии TIMP1 в группах с быстропрогрессирующим течением (грейд С) и хроническим сложным (грейд В) пародонтитом не имел значимых различий ни по одному из изученных параметров экспрессии TIMP1 (рис. 3, см. табл. 5).
Рис. 3. Характер экспрессии TIMP1 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита
Примечание. Медиана — круг; 25–75% — Мин–Макс; * — р < 0,05; ** — р < 0,001.
Таблица 5. Параметры экспрессии TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита
Контроль | БПП, грейд С | ХПП, грейд В | ХСП, грейд В | |
TIMP1 — Me (IQR) | ||||
eTIMP1_Positivity | 32 (8:57) | 84 (55:97) | 61 (38:82) | 83 (61:95) |
eTIMP1_Nsr+p | 0,4 (0,1:1) | 7,9 (0,9:88) | 2,16 (0,37:11,3) | 14 (2:53) |
eTIMP1_index | 210 (207:213) | 188 (144:208) | 198 (188:213) | 185 (167:200) |
eTIMP1_INDEX | 207 (205:211) | 188 (147:208) | 201 (185:210) | 185 (167:202) |
sTIMP1_Positivity | 5 (3:7) | 15 (6:44) | 4,5 (3:11,5) | 16 (8:31) |
sTIMP1_Nsr+p | 0,25 (0,1:0,5) | 4 (0,5:24) | 0,6 (0,07:2,99) | 3,5 (1,39:10,8) |
sTIMP1_index | 205 (202:207) | 188 (164:201) | 200 (188:208) | 187 (178:196) |
sTIMP1_INDEX | 201 (198:203) | 191 (169:199) | 197 (190:202) | 186 (177:196,5) |
allTIMP1_Positivity | 20 (5:32) | 49 (21:77,5) | 20,7 (12:26) | 42 (26:59) |
allTIMP1_Nsr+p | 0,6 (0,2:0,5) | 26 (0,5:60,1) | 1,66 (0,3:2,9) | 13 (1,1:13,8) |
allTIMP1_index | 209 (206:212) | 178 (141:207) | 204 (194:212) | 187 (179:203) |
allTIMP1_INDEX | 204 (201:206) | 178 (151:204) | 197 (188:205) | 186 (178:200) |
TIMP2 — Me (IQR) | ||||
eTIMP2_Positivity | 70 (35:87,5) | 98 (69,5:100) | 99 (96:100) | 94 (50:99) |
eTIMP2_Nsr+p | 5,1 (1,0:17,5) | 89,6 (4:98,8) | 97,8 (87:99,2) | 89,8 (27,4:98,7) |
eTIMP2_index | 196 (186:201) | 151 (127:200) | 129 (118:141) | 142 (120:165) |
eTIMP2_INDEX | 196 (188:202) | 151 (127:203) | 130 (118:141) | 143 (120:170) |
sTIMP2_Positivity | 15 (10:22) | 29,5 (10:57) | 42,5 (28,5:58,5) | 28,5 (9:53,5) |
sTIMP2_Nsr+p | 4 (1,7:7,2) | 15,2 (1,7:30,5) | 21,7 (12,6:34,1) | 14,1 (3,5:31,2) |
sTIMP2_index | 189 (182:193) | 169 (156:195) | 166 (154:175) | 167 (156:180) |
sTIMP2_INDEX | 193 (189:195) | 180 (167:198) | 175 (166:184) | 171 (161:179) |
allTIMP1_Positivity | 42 (16,5:59,5) | 60,3 (48:82) | 77 (73:82) | 54 (29,5:76,5) |
allTIMP1_Nsr+p | 10 (1,5:15,2) | 42,5 (2,9:69,2) | 64,8 (60:68) | 43,7 (20:66,7) |
allTIMP1_index | 192 (187:199) | 159 (131:201) | 134 (128:138) | 148 (131:162) |
allTIMP1_INDEX | 193 (188:199) | 165 (144:201) | 145 (140:149) | 153 (139:167) |
Результаты анализа экспрессии TIMP2 выявили похожие тенденции. Так, в группах пациентов с различным характером течения пародонтита отмечались значимо более высокие параметры позитивности и интенсивности экспрессии TIMP2 по сравнению с группой контроля (рис. 4, см. табл. 5). При этом уровни экспрессии возрастали в направлении от предимплантационных биопсий к быстропрогрессирующему (грейд С) и хроническому сложному (грейд В) пародонтиту и были наивысшими в группе пациентов с хроническим простым пародонтитом (грейд В), что подтверждается результатами парного сравнения групп.
Рис. 4. Характер экспрессии TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита
Примечание. Медиана – круг; 25–75% — Мин–Макс; * — р < 0,05; ** — р < 0,001.
Характер экспрессии TIMP2 в группах пациентов с быстропрогрессирующим (грейд С) и хроническим сложным (грейд В) пародонтитом не имел статистически значимых отличий по параметрам общей и стромальной позитивности экспрессии маркера. Одновременно в группе быстропрогрессирующего пародонтита (грейд С) отмечались более высокие параметры позитивности эпителиальной экспрессии TIMP2 и более низкие уровни интенсивности его общей, эпителиальной и стромальной экспрессии.
Выполненный ROC-анализ показал, что наиболее информативными параметрами экспрессии TIMP1 и TIMP2 в дифференциальной диагностике пародонтита, особенно на стадии манифестации заболевания, явились показатели общей и эпителиальной экспрессии:
- TIMР1 — позитивность и доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью общей экспрессии, позитивность эпителиальной экспрессии, общий индекс интенсивности и индекс общей интенсивности иммуногистохимической реакции в иммунопозитивных участках (рис. 5);
- TIMР2 — позитивность общей экспрессии, общий индекс интенсивности эпителиальной экспрессии и индекс интенсивности эпителиальной экспрессии в иммунопозитивных участках (рис. 6).
Рис. 5. Информативность показателей TIMP1 для дифференциальной диагностики быстропрогрессирующего (грейд С) с хроническими формами (грейд В) пародонтита
Рис. 6. Информативность показателей TIMP2 для дифференциальной диагностики быстропрогрессирующего (грейд С) с хроническими формами (грейд В) пародонтита
Проведенный корреляционный анализ параметров экспрессии TIMPs и изученных нами ранее MMPs [24] выявил обратную взаимосвязь параметров экспрессии TIMP1 с наиболее значимыми для быстропрогрессирующего течения пародонтита (грейд С) MMP1 (ρ = –0,40), ММР8 (ρ = –0,34), ММР13 (ρ = –0,46), ММР14 (ρ = –0,24) и прямую взаимосвязь с ММР9 (ρ = 0,37). Характер экспрессии TIMP2 также обратно коррелировал с таковым ММР8 (ρ = –0,41), ММР9 (ρ = –0,32) и имел прямую взаимосвязь с экспрессией MMP1 (ρ = 0,32), ММР2 (ρ = 0,37), ММР13 (ρ = 0,39), ММР14 (ρ = 0,36), р < 0,05.
Нежелательные явления
Нежелательные явления в ходе проведения исследования не отмечены.
Обсуждение
Несмотря на то что основной функцией TIMPs является ингибирование MMPs, они могут принимать участие в транспортировке и стабилизации MMPs, а экспрессия самих TIMPs может зависеть от спектра и уровней экспрессии MMPs, образуя очень сложную многоуровневую систему регуляции [12]. Увеличение при воспалении экспрессии MMPs и относительно более низкие уровни экспрессии TIMPs инициируют деградацию коллагена соединительной ткани пародонта и альвеолярного отростка кости. Большинство современных исследований в пародонтологии сконцентрировано на изучении MMPs и TIMPs в биологических жидкостях. Так, показано, что появление MMPs и TIMPs в слюне, десневой жидкости или сыворотке крови может свидетельствовать о прогрессировании заболевания [25], а избыточное количество продуктов распада коллагена в десневой жидкости и слюне может быть использовано для прогнозирования потери альвеолярной кости при пародонтите [26]. Преимуществом исследования биологических жидкостей является относительная простота и неизвазивность методов, а недостатком – невозможность с уверенностью исключить влияние на уровни MMPs и TIMPs системных заболеваний и некоторых нозологий местных заболеваний полости рта. В нашем исследовании анализ MMPs и TIMPs в бипсийном материале десны показывает истинные уровни их экспрессии и исключает неоднозначность трактовки полученных результатов.
Резюме основного результата исследования
В рамках проведенного исследования показаны особенности экспрессии TIMP1 и TIMP2 и их взаимосвязь с уровнями экспрессии MMPs в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита, а также установлены диапазоны с «точками отсечения» параметров экспрессии изученных TIMPs для выделения группы пациентов с быстропрогрессирующим течением пародонтита уже на стадии манифестации заболевания.
Обсуждение основного результата исследования
Повышение уровней экспрессии TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с патологией пародонта на фоне вариабельной экспрессии ингибируемых ими MMPs подтверждает роль данных биомолекулярных маркеров в развитии и скорости прогрессирования воспаления с дезорганизацией экстрацеллюлярного матрикса как тканей пародонта, так и альвеолярного отростка кости. При этом наиболее трудно дифференцируемый по клинико-рентгенологическим данным быстропрогрессирующий (грейд С) и хронический сложный (грейд В) пародонтит характеризовался практически сопоставимыми уровнями экспрессии изученных TIMPs, за исключением более высоких параметров позитивности эпителиальной экспрессии и более низкой интенсивности ее экспрессии TIMP2.
Аналогичных по дизайну исследований в литературе не обнаружено. Большинство из них касается в основном определения TIMPs в биологических жидкостях и имеет достаточно противоречивые результаты, в том числе об отсутствии различий [27, 28] и, наоборот, о более низких уровнях TIMP1 в слюне пациентов с пародонтитом (в целом или только хроническими формами) по сравнению со здоровыми людьми [29]. Результаты проведенного корреляционного анализа показали обратную взаимосвязь параметров экспрессии TIMPs с таковыми MMPs, в том числе с наиболее значимыми для развития быстропрогрессирующего характера течения пародонтита (грейд С) ММР1, ММР8 и ММР14, и согласуются с представлениями о патегенезе воспаления пародонта и данными других исследователей [30].
Также по-своему уникальными с точки зрения практического использования являются полученные параметры экспрессии TIMP1 и TIMP2 с целью классификации и определения скорости прогрессирования пародонтита на стадии первичной диагностики, среди которых наиболее информативны все изученные параметры общей экспрессии и позитивность эпителиальной экспрессии TIMP1, а также позитивность общей экспрессии и интенсивность эпителиальной экспрессии TIMP2.
Ограничения исследования
Немногочисленность групп обследования связана с относительно низкой частотой выявления отдельных форм патологии пародонта (в частности, быстропрогрессирующего пародонтита, грейд С), трудоемкостью и временными затратами на выполнение клинико-рентгенологических и морфологических исследований, а также стоимостью морфологического и иммуногистохимического исследования.
Заключение
Полученные нами результаты позволяют уточнить некоторые аспекты патогенеза различных форм пародонтита, что дополняет фундаментальные знания в данной области медицины и может способствовать совершенствованию подходов к таргетной регуляции активности изученных молекул, а также обладают прикладным значением в части использования параметра экспрессии TIMP1 и TIMP2 для выделения группы пациентов с быстропрогрессирующим характером течения пародонтита (грейд С) уже на стадии манифестации заболевания. Все это может способствовать максимально ранней индивидуализации лечения пациентов, особенно молодого возраста с быстропрогрессирующим течением пародонтита (грейд С), с целью предупреждения или замедления потери зубов, а также сохранения и/или улучшения качества жизни данной группы пациентов.
Дополнительная информация
Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках проекта «Разработать и внедрить метод диагностики быстропрогрессирующего периодонтита, основанный на определении в тканях периодонта матриксных металлопротеиназ» 2018–2020 № ГР 20180436 подпрограммы «Внутренние болезни» государственной научно-технической программы «Новые методы оказания медицинской помощи» 2016–2020.
Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.
Участие авторов. Л.А. Казеко — разработка цели, концепции и дизайна исследования, набор пациентов в группы, их обследование и лечение, написание текста и утверждение финальной версии рукописи; В.А. Захарова — согласование концепции и дизайна исследования, статистическая обработка, обобщение данных, критический анализ и корректировка текста рукописи, формата представления полученных результатов; Ю.Д. Бенеш — поиск публикаций по теме, перевод их на русский язык, морфометрический анализ гистологических изображений, написание текста рукописи; Е.Д. Черствый — согласование и утверждение концепции и дизайна исследования, критический анализ и корректировка текста рукописи, формата представления полученных результатов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
About the authors
Ludmila A. Kazeko
Belarusian State Medical University
Author for correspondence.
Email: 1kaf.terstom@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0821-0366
SPIN-code: 7607-7910
MD, PhD, Associate Professor
Белоруссия, MinskViktoryia A. Zakharava
N.N. Alexandrov National Cancer Centre of Belarus
Email: zakharava.vikt@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2050-9800
SPIN-code: 6638-7980
MD, PhD, Associate Professor
Белоруссия, LesnoyJulia D. Benesh
Belarusian State Medical University
Email: julia.benesh@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3207-9203
SPIN-code: 8744-8970
assistant
Белоруссия, MinskEugeny D. Cherstvoy
Belarusian State Medical University
Email: patanat@bsmu.by
ORCID iD: 0000-0002-2554-1431
SPIN-code: 1350-0976
MD, PhD, Professor
Белоруссия, MinskReferences
- Tatakis D, Kumar P. Etiology and Pathogenesis of Periodontal Diseases. Dent Clin North Am. 2005;49(3):491–516. doi: https://doi.org/10.1016/j.cden.2005.03.001
- Verma R, Hansch C. Matrix metalloproteinases (MMPs): Chemical–biological functions and (Q)SARs. Bioorg Med Chem. 2007;15(6):2223–2268. doi: https://doi.org/10.1016/j.bmc.2007.01.011
- Григоркевич О.С., Мокров Г.В., Косова Л.Ю. Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы // Фармакокинетика и фармакодинамика. — 2019. —№ 2. — С. 3–16. [Grigorkevich OS, Mokrov GV, Kosova LYu. Matrix metalloproteinases and their inhibitors. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2019;2:3–16. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.24411/2587-7836-2019-10040
- Gupta S. Quantitative structure-activity relationship studies on zinc-containing metalloproteinase inhibitors. Chem Rev. 2007;107(7):3042–3087. doi: https://doi.org/10.1021/cr030448t
- Maskos K. Crystal structures of MMPs in complex with physiological and pharmacological inhibitors. Biochimie. 2005;87(3–4):249–263. doi: https://doi.org/10.1016/j.biochi.2004.11.019
- Cathcart JM, Cao J. MMP Inhibitors Past present and future. Front Biosci (Landmark Ed). 2015;20(7):1164–1178. doi: https://doi.org/10.2741/4365
- Whittaker M, Ayscought A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors – current status and future challenges. Celltransmissions. 2001;17(1):3–14.
- Gomez DE, Alonso DF, Yoshiji H, et al. Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. Eur J Cell Biol. 1997;74(2):111–122.
- Herron GS, Banda MJ, Clark EJ et al. Secretion of metalloproteinases by stimulated capillary endothelial cells. II. Expression of collagenase and stromelysin activities is regulated by endogenous inhibitors. J Biol Chem. 1986;261(6):2814–2818.
- De Clerck Y, Yean TD, Ratzkin BJ, et al. Purification and characterization of two related but distinct metalloproteinase inhibitors secreted by bovine aortic endothelial cells. J Biol Chem. 1989;264(29):17445–17453.
- Kubota T, Matsuki Y, Nomura T, et al. In situ hybridization study on tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) mRNA-expressing cells in human inflamed gingival tissue. J Periodontal Res. 1997;32(5):467–472. doi: https://doi.org/10.1111/j.1600-0765.1997.tb00559.x
- Pavloff N, Staskus PW, Kishnani NS, etg al. A new inhibitor of metalloproteinases from chicken: ChIMP-3. A third member of the TIMP family. J Biol Chem. 1992;267(24):17321–17326.
- Apte S, Hayashi K, Seldin M, et al. Gene encoding a novel murine tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP), TIMP-3, is expressed in developing mouse epithelia, cartilage, and muscle, and is located on mouse chromosome 10. Dev Dyn. 1994;200(3):177–197. doi: https://doi.org/10.1002/aja.1002000302
- Greene J, Wang M, Liu YE, et al. Molecular cloning and characterization of human tissue inhibitor of metalloproteinase 4. J Biol Chem. 1996;271(48):30375–30380. doi: https://doi.org/10.1074/jbc.271.48.30375
- Bigg H, Shi Y, Liu Y, et al. Specific, high affinity binding of tissue inhibitor of metalloproteinases-4 (TIMP-4) to the COOH-terminal hemopexin-like domain of human gelatinase A. J Biol Chem. 1997;272(24):15496–15500. doi: https://doi.org/10.1074/jbc.272.24.15496
- Tokuhara C, Santesso M, Oliveira G, et al. Updating the role of matrix metalloproteinases in mineralized tissue and related diseases. J Appl Oral Sci. 2019;27:e20180596. doi: https://doi.org/10.1590/1678-7757-2018-0596
- Chang Y-Ch, Yang S-F, Lai Ch-Ch, et al. Regulation of matrix metalloproteinase production by cytokines, pharmacological agents and periodontal pathogens in human periodontal ligament fibroblast cultures. J Periodontal Res. 2002;37(3):196–203. doi: https://doi.org/10.1034/j.1600-0765.2002.00663.x
- Mouzakiti E, Pepelassi E, Fanourakis G, et al. Expression of MMPs and TIMP-1 in smoker and nonsmoker chronic periodontitis patients before and after periodontal treatment. J Periodontal Res. 2012;47(4):532–542. doi: https://doi.org/10.1111/j.1600-0765.2011.01465.x
- Rathnayake N, Åkerman S, Klinge B, et al. Salivary biomarkers of oral health — a cross-sectional study. J Clin Periodontol. 2012;40(2):140–147. doi: https://doi.org/10.1111/jcpe.12038
- Mattot V, Raes MB, Henriet P, et al. Expression of interstitial collagenase is restricted to skeletal tissue during mouse embryogenesis. J Cell Sci. 1995;108(2):529–535. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.108.2.529
- Chin JR, Werb Z. Matrix metalloproteinases regulate morphogenesis, migration and remodeling of epithelium, tongue skeletal muscle and cartilage in the mandibular arch. Development. 1997;124(8):1519–1530. doi: https://doi.org/10.1242/dev.124.8.1519
- Dew G, Murphy G, Stanton H, et al. Localisation of matrix metalloproteinases and TIMP-2 in resorbing mouse bone. Cell Tissue Res. 2000;299(3):385–394. doi: https://doi.org/10.1007/s004419900166
- Hatori K, Sasano Y, Takahashi I, et al. Osteoblasts and osteocytes express MMP2 and -8 and TIMP1, -2, and -3 along with extracellular matrix molecules during appositional bone formation. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 2004;277(2):262–271. doi: https://doi.org/10.1002/ar.a.20007
- Казеко Л.А., Захарова В.А., Анфиногенова Е.А., и др. Значение экспрессии матриксных металлопротеиназ в дифференциальной диагностике патологии пародонта // Архив патологии. — 2021. — Т. 83. — № 3. — С. 20–29. [Kazeko LA, Zakharava VA, Anfinogenova EA, et al. The significance of the expression of matrix metalloproteinases in the differential diagnosis of periodontal diseases. Arkhiv Patologii. 2021;83(3):20–29. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.17116/patol20218303120
- Soell M, Elkaim R, Tenenbaum H. Cathepsin C, matrix metalloproteinases, and their tissue inhibitors in gingiva and gingival crevicular fluid from periodontitis-affected patients. J Dent Res. 2002;81(3):174–178.
- Taba M, Kinney J, Kim A, et al. Diagnostic biomarkers for oral and periodontal diseases. Dent Clin North Am. 2005;49(3):551–571. doi: https://doi.org/10.1016/j.cden.2005.03.009
- Balogun AO, Taiwo JO, Opeodu OI, et al. Impact of Non-Surgical Periodontal Therapy on the Salivary Levels of Tissue Inhibitor of Metalloproteinse-1 (TIMP-1) in Patients with Chronic Periodontitis: A Third World Experience. Open Journal of Stomatology. 2021;11:197–207. doi: https://doi.org/10.4236/ojst.2021.115017
- de Brouwer P, Bikker FJ, Brand HS, et al. Is TIMP-1 a biomarker for periodontal disease? A systematic review and meta-analysis. J Periodont Res. 2021;57(2):235–245. doi: https://doi.org/10.1111/jre.12957
- Bostanci N., Mitsakakis K., Afacan B, et al. Validation and verification of predictive salivary biomarkers for oral health. Sci Rep. 2021;11(1):6406. doi: https://doi.org/10.1038/s41598-021-85120-w
- Pozo P, Valenzuela MA, Melej C, et al. Longitudinal analysis of metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases and clinical parameters in gingival crevicular fluid from periodontitis-affected patients. J Periodontal Res. 2005;40(3):199–207. doi: https://doi.org/10.1111/j.1600-0765.2005.00786.x
Supplementary files
