Отправить статью по E-mail 
Роль экспрессии тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ в патогенезе и дифференциальной диагностике патологии пародонта
- Авторы: Казеко Л.А.1, Захарова В.А.2, Бенеш Ю.Д.1, Черствый Е.Д.1
-
Учреждения:
- Белорусский государственный медицинский университет
- Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова
- Выпуск: Том 78, № 3 (2023)
- Страницы: 213-226
- Раздел: АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ СТОМАТОЛОГИИ
- Дата публикации: 03.07.2023
- URL: https://vestnikramn.spr-journal.ru/jour/article/view/2041
- DOI: https://doi.org/10.15690/vramn2041
- ID: 2041
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Обоснование. Баланс металлопротеиназ (MMPs) и их тканевых ингибиторов (TIMPs) имеет решающее значение для манифестации и прогрессирования заболеваний пародонта и является одним из перспективных направлений научных исследований в части разработки способов селективного ингибирования ММРs. Цель исследования — установить значение параметров экспрессии TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десны для определения характера течения пародонтита на этапе манифестации заболевания. Методы. Проведено проспективное исследование с параллельным включением пациентов с различными формами пародонтита в сравниваемые группы. Патоморфологическое исследование с морфометрическим анализом экспрессии TIMPs и последующим статистическим анализом данных выполнено с использованием AperioImageScope v. 12.4.0.5043, Statistica 10.0, MedCalc 19.6. Результаты. В исследование включено 67 пациентов с быстропрогрессирующим (БПП, агрессивный, грейд С, n = 19), хроническим простым (ХПП, грейд В, n = 10), хроническим сложным (ХСП при наличии окклюзионной травмы, грейд В, n = 38) пародонтитом и 15 условно здоровых пациентов (группа сравнения). Экспрессия TIMP1 и TIMP2 выявлялась с вариабельной позитивностью и интенсивностью как в эпителии, так и в строме десны и значимо превышала в различных группах пародонтитов таковую группы сравнения (МеTIMP1/2 = 32%/70%), р < 0,05. Параметры экспрессии TIMP1 и TIMP2 не имели значимых различий в группах с БПП (МеTIMP1/2 = 84%/98%) и ХСП (МеTIMP1/2 = 83%/94%), за исключением более высокой позитивности эпителиальной экспрессии TIMP2 (U = 61 372; р < 0,05) и более низкой интенсивности его экспрессии при БПП (МеБПП/ХСП = 180/171; U = 56 491; р < 0,001). Корреляционный анализ выявил обратную взаимосвязь параметров экспрессии TIMPs с таковыми MMPs, в том числе с наиболее значимыми для развития БПП ММР1 (ρ = –0,40), ММР8 (ρ = –0,34) и ММР14 (ρ = –0,24). ROC-анализ подтвердил приемлемую информативность всех изученных параметров общей экспрессии и позитивности эпителиальной экспрессии TIMP1, а также позитивности общей экспрессии и интенсивности эпителиальной экспрессии TIMP2 для дифференциальной диагностики быстро и медленно прогрессирующих форм пародонтита на стадии манифестации заболевания. Заключение. Полученные нами результаты показывают повышение экспрессии TIMP1 и TIMP2 при различных формах пародонтита и обратную взаимосвязь с ингибируемыми ими ММРs. Это дополняет фундаментальные знания о развитии и прогрессировании патологии пародонта и может обладать прикладным значением в части использования изученных критериев экспрессии TIMP1 и TIMP2 для установления быстро прогрессирующего характера течения пародонтита уже на стадии манифестации заболевания, что позволит индивидуализировать лечение, предупредить или замедлить потерю зубов с целью сохранения и/или улучшения качества жизни данной группы пациентов.
Полный текст
Обоснование
Основная роль в деградации соединительной ткани и альвеолярного отростка кости при парадонтите принадлежит активированным ферментам клеток-хозяев [1], среди которых наиболее значимую группу представляют матриксные металлопротеиназы (ММРs). Выделяют два основных пути регуляции активности ММРs: протеолитическую активацию неактивных ферментов (pro-ММР) и взаимодействие с ингибиторами матриксных металлопротеиназ (TIMPs).
ТIМРs представляют собой тканеспецифические эндогенные ингибиторы ММРs, дезинтегрина и металлопротеиназ с мотивами тромбоспондина (ADAMTS) [2], которые образуют прочные нековалентные комплексы с активным центром ММРs и снижают их активность в соотношении 1:1 [3]. ТIМРs объединены в семейство, состоящее из четырех гомогенных ферментов с приблизительно сопоставимым потенциалом [3–5]. В последовательности генов всех четырех ТIМРs не выявлено большого сходства, что свидетельствует об уникальной биологической роли каждого из них. Все TIMPs представлены двумя доменами, связанными между собой шестью дисульфидными связями: малым C-концевым и большим N-концевым, представляющим собой остаток Cys, который связывается с активным Zn2+-связывающим центром MMP в эквимолярном соотношении, вследствие чего и наблюдается ингибирование. С-концевой домен задействован в активации pro-MMP [3, 6].
TIMP1 впервые был выделен на культуре человеческих фибробластов. TIMP1 связывается с неактивным pro-MMP9, образуя комплекс, в котором TIMP1 сохраняет способность ингибировать активность другого активного MMP через его N-концевой домен [7]. TIMP1 широко синтезируется многими клетками и тканями организма, а транскрипция гена TIMP1 индуцируется провоспалительными цитокинами (IL-1, IL-6, OSM, LIF и TNF-α), TGF-β [7, 8]. TIМР1 играет важную роль в активации незрелых клеток пульпы для нормального дентиногенеза, его экспрессия повышается при воспалении и онкогенезе.
TIMP2 был впервые обнаружен при разработке техники обратной зимографии [9]. Y. De Clerсk et al. [10] выделили этот белок из бычьей эндотелиальной клеточной культуры. TIMP2 ингибирует все MMPs, однако наиболее сильное ингибирующее действие он оказывает на MMP8 [11].
В 1990 г. N. Pavloff et al. идентифицировали TIMP3 [12]. Клоны TIMP3 человека и мыши были секвенированы S. Apte et al. в 1992 г. [13]. TIMP3 является уникальным среди TIMPs млекопитающих по ингибированию более широкого ряда MMPs, включая несколько членов семейств ADAM и ADAMTS [9].
TIMP4 впервые был идентифицирован при клонировании [14], мРНК обнаружена в тканях сердца, в более низких концентрациях — в почках, плаценте, толстой кишке. TIMP4 сопоставим с TIMP2 в его способности связываться с pro-MMP2 [15] и способен ингибировать ММР1, 2, 3, 7, 9.
Все TIMPs не специфичны и способны ингибировать все известные MMPs, хотя наблюдается определенная предпочтительность связывания (табл. 1) [16].
Таблица 1. Предпочтительное ингибирование MMPs известными TIMPs
MMPs | TIMPs | Источник [16] |
MMP1 | TIMP4 | Radomski et al. (2002) |
MMP2 | TIMP2, TIMP3, TIMP4 | Chowdhury et al. (2015); Suomela et al. (2001); Radomski et al. (2002) |
MMP7 | TIMP1, TIMP4 | Bourboulia, Stetler-Stevenson (2010); Radomski et al. (2002) |
MMP8 | TIMP1 | Hästbacka et al. (2015) |
MMP9 | TIMP1, TIMP3, TIMP4 | Mittal et al. (2016); Suomela et al. (2001); Radomski et al. (2002) |
MMP12 | TIMP1 | Suomela, et al. (2001) |
MMP13 | TIMP3 | Suomela, et al. (2001) |
MMP14 | TIMP2, TIMP4 | Itoh (2015); Radomski, et al. (2002) |
Разрушение пародонтальной связки и альвеолярной кости при пародонтите отражает относительную сверхэкспрессию MMPs по отношению к TIMPs и может быть уменьшено при восстановлении этого баланса. Показано, что ингибирование экспрессии или активности MMPs или увеличение экспрессии TIMPs может снизить скорость разрушения тканей при пародонтите [17]. Согласно данным Е. Mouzakiti et al. [18], на фоне лечения пародонтита значительно увеличивалась экспрессия TIMP1 и уменьшилось соотношение MMPs/TIMP1. Экспрессия TIMP1 у пациентов с болезнями пародонта сразу после лечения была выше таковой у здоровых пациентов [18], и уровни TIМР1, TIMP2 постепенно снижались после терапии болезней пародонта [19].
Научными исследованиями доказано, что TIMP1, 2 и 3 участвуют в формировании эмбриональной кости [20, 21], а TIMP1 и 2 [22] — и в постнатальном развитии костей. Установлено, что остеобласты и остеоциты экспрессируют TIMP1, 2 и 3 [20–22]. Согласно данным K. Hatori et al. [23], MMPs и TIMPs могут играть ключевую роль в постнатальном аппозиционном формировании кости и созревании костного матрикса посредством ремоделирования молекул внеклеточного матрикса. Дальнейшее изучение этого вопроса актуально для понимания биологической интеграции искусственного материала с костью для клинических целей, например восстановления костных дефектов искусственными заменителями, в том числе при патологии пародонта и установке дентальных имплантатов.
Баланс MMPs и TIMPs имеет решающее значение для разрушения соединительнотканного матрикса как при физиологических, так и при патологических состояниях. Поэтому по-прежнему сохраняет актуальность изучение взаимосвязи между MMPs и TIMPs как отражение особенностей течения и прогрессирования заболеваний пародонта. Дальнейшие научные исследования по разработке способов регулирования активности ферментов с селективным ингибирующим действием на ММРs и других членов семейства металлопротеиназ [6] могут помочь предупредить или замедлить частичную или полную потерю зубов и сохранить качество жизни пациентов с патологией пародонта.
Цель исследования — установить значение параметров экспрессии TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десны для определения характера течения пародонтита на этапе манифестации заболевания.
Методы
Дизайн исследования
Проведено проспективное исследование с параллельным включением в сравниваемые группы пациентов с различными формами пародонтита.
Критерии соответствия
При формировании групп исследования использовались критерии классификаций пародонтитов, приведенные в табл. 2.
Таблица 2. Международные и региональные классификации пародонтитов, действующие в период формирования групп и проведения исследования
1999 Classification of Periodontitis | Клиническая классификация (региональная) 2002–2019 | МКБ-10 | 2018 AAP Periodontal Classification |
Chronic periodontitis | Хронический периодонтит (К05.3): сложный (с деструкцией периодонтальной связки и межальвеолярной кости с наличием вертикальной резорбции и окклюзионной травмы); простой (с деструкцией периодонтальной связки и межальвеолярной кости с наличием горизонтальной резорбции) | К05.3 Хронический пародонтит: БДУ; сложный; простой | Periodontitis Grade В |
Aggressive periodontitis | Быстропрогрессирующий периодонтит (К05.4) | В МКБ-10 форма быстропрогрессирующего пародонтита взрослых ошибочно не учтена | Periodontitis Grade C |
Критерии включения:
- наличие быстропрогрессирующего (БПП, грейд С), хронического простого (ХПП, грейд В) и сложного (ХСП с окклюзионной травмой, грейд В) пародонтита;
- возраст — 18–60 лет (18–35 лет — для быстропрогрессирующего, 36–60 лет — для хронического простого и сложного пародонтита);
- лица мужского и женского пола;
- информированное согласие пациентов для проведения исследования.
Критерии исключения:
- отказ пациента от исследования;
- возраст пациентов до 18 лет и старше 60 лет;
- беременность или лактация (женщины);
- медицинский или психиатрический риск, нарушающий получение анамнестической информации;
- наличие острого инфекционного процесса челюстно-лицевой области;
- наличие тяжелой сопутствующей соматической и инфекционной патологии;
- остеопороз и хронические заболевания, связанные с риском его развития;
- прием медикаментов, влияющих на минеральную плотность костной ткани (при подозрении на быстропрогрессирующее течение пародонтита).
Условия проведения
Клинико-инструментальное исследование и обследование пациентов с использованием лучевых методов диагностики проведено на 1-й кафедре терапевтической стоматологии УО «Белорусский государственный медицинский университет» на базе ГУ «Республиканская клиническая стоматологическая поликлиника» и включало: оценку гигиены полости рта (OHI-S), тяжести воспаления десны (GI); определение глубины зондирования пародонтальных карманов и утери прикрепления (LA), рецессии десны, поражения фуркации, патологической миграции зубов, их подвижности, наличия окклюзионной травмы с регистрацией всех результатов обследования в пародонтальной карте; выполнение общего и биохимического анализа крови, анализа крови на тиреоидные гормоны и остеоденситометрии для исключения соматической патологии, влияющей на состояние пародонта; обследование с применением методов лучевой диагностики (панорамной рентгенографии или компьютерной томографии) для оценки уровня и характера резорбции костной ткани. Морфологический раздел выполнен на базе кафедры патологической анатомии УО «Белорусский государственный медицинский университет».
Продолжительность исследования
Исследовался биопсийный материал десен пациентов с патологией пародонта, обратившихся за медицинской помощью в период 2018–2020 гг.
Описание медицинского вмешательства
Полость рта в области поражения и планируемой биопсии обрабатывалась антисептическим лекарственным средством с проведением инфильтрационной анестезии. Далее выполнялся кюретаж пародонтальных карманов с взятием инцизионной биопсии краевой десны в области медиального или дистального сосочков в участках максимального клинически определяемого поражения пародонта, включая боковую стенку пародонтального кармана, с использованием острых хирургических ножниц или скальпеля малого брюшистого № 15. Оптимальный размер биоптата не должен был быть менее 1,5 мм в толщину и 2–3 мм в высоту. Иссеченный участок десны переносился на полоску фильтровальной бумаги размером 2,0 × 5,0 см, которая складывалась в 3–4 слоя и перевязывалась 2–3 узлами шовного материала для удержания биоптата в расправленном состоянии с целью исключения его пространственной деформации и получения правильно ориентированных срезов для патогистологического исследования с погружением биопсийного материала в емкость с 10%-м раствором нейтрального формалина. Послеоперационная рана промывалась антисептическим лекарственным средством с последующим гемостазом компрессией и контрольным осмотром на следующий день.
Исходы исследования
Определение параметров экспрессии TIMP1 и TIMP2 с использованием программы AperioImageScope в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита:
- позитивность (Positivity) — отношение числа позитивных пикселей к общему числу позитивных и негативных пикселей × 100%;
- доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью (Nsr+p) — отношение числа позитивных пикселей с высокой и умеренной интенсивностью к общему числу позитивных и негативных пикселей × 100%;
- индекс интенсивности в иммунопозитивных участках (TIMPs_index) — отношение суммы интенсивностей пикселей с высокой, средней и низкой интенсивностью к числу позитивных пикселей;
- общий индекс интенсивности ИГХ-реакции (TIMPs_INDEX) — отношение суммы интенсивностей негативных и позитивных пикселей к общему числу позитивных и негативных пикселей.
Методы регистрации исходов
Биопсийный материал десен дегидратировался в спиртах восходящей концентрации при помощи тканевого процессора, заключался в парафин с ориентацией плоскости биопсийного среза перпендикулярно плоскости среза парафинового блока с использованием заливочного центра с наличием «холодной точки» для правильной его ориентации. Из блоков изготавливались гистологические срезы толщиной 2,5 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином и заключались в «канадский бальзам» или аналогичную среду, покрывались покровным стеклом.
Оценке подлежали выраженность и состав воспалительной инфильтрации в сосочковом и сетчатом слоях десны, наличие межэпителиальных лейкоцитов, наличие некроза или гипертрофии коллагеновых волокон, кровоизлияний, наличие и характер дистрофии в эпителиальном компоненте десны, ее эрозирование, десквамация эпителия, акантоз.
С парафиновых блоков наиболее информативных гистологических препаратов изготавливались срезы толщиной 2,5 мкм, которые после депарафинизации окрашивались с использованием иммуногистохимического метода (ИГХМ). Протоколы иммуногистохимического окрашивания с моноклональными антителами к TIMP1 и TIMP2 и характеристика выявленной экспрессии указаны в табл. 3.
Таблица 3. Ключевые особенности иммуногистохимического метода для выявления TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита
Первичное антитело | TIMP1 | TIMP2 |
Происхождение антител | Rabbit | Mouse |
Демаскировочный буфер, рН | pH = 9,0 125o 2’30’’ | pH = 9,0 125o 2’30’’ |
Разведение | 1:50 | 1:800 |
Время экспозиции хромогена, мин | 4 | 5 |
Позитивный контроль | Предстательная железа | Почка |
Характер экспрессии | Гомогенное цитоплазматическое и мембранное окрашивание в коричневый цвет различной интенсивности лейкоцитов/гистиоцитов, эпителия десны, фибробластов, эндотелиоцитов (TIMP2) | |
В последующем выполнялось сканирование иммуногистохимических препаратов цифровым слайд-сканером MoticEasyScan с анализом полученных изображений при помощи AperioImageScope v. 12.4.0.5043. Проводилось выделение 9 случайных непересекающихся полей зрения (цифровое увеличение — ×20) с анализом иммуногистохимического окрашивания отдельно в эпителиальном и стромальном компоненте десны, а также полей, включающих в равной пропорции как эпителиальный, так и стромальный компонент (по 3 поля зрения). В рамках программного анализа экспрессии TIMPs в ткани десны интенсивность продуктов реакции диаминбензидина измерялась AperioImageScope автоматически и разделялась на три уровня интенсивности и негативную реакцию. Результат программной оценки параметров позитивности и доли пикселей с высокой и умеренной экспрессией имел прямую взаимосвязь, а интенсивность экспрессии — обратную взаимосвязь с данными визуальной оценки.
Этическая экспертиза
Этическая экспертиза проведена на заседании комитета по биомедицинской этике Белорусского государственного медицинского университета (протокол № 13 от 28 июня 2018 г.) с одобрением плана проведения и дизайна настоящего исследования и необходимости получения информированного согласия на обследование и лечение от каждого тематического пациента.
Статистический анализ
Принципы расчета размера выборки. Размер выборки предварительно не рассчитывался, а определялся количеством пациентов, соответствующих установленным критериям включения и исключения.
Методы статистического анализа данных. Статистический анализ данных проводился с использованием программного обеспечения Statistica 10.0, MedCalc 19.6. Поскольку распределение данных с использованием критерия Шапиро–Уилка (W) в некоторых из групп отличалось от нормального, для анализа данных применены методы непараметрической статистики с вычислением медианы (Ме), интерквартильного (IQR) и 95%-го доверительного интервалов, максимального и минимального значений. Сравнение независимых выборок по количественным признакам осуществляли с использованием дисперсионного анализа непараметрических данных ANOVA и определением критериев Краскела–Уоллиса (Н), Манна–Уитни (U-критерий) и хи-квадрат (χ2). Анализ взаимосвязи исследуемых параметров выполнен с использованием критерия Спирмена (ρ). С целью решения задачи классификации пародонтитов и оценки ее диагностической эффективности выполнен ROC-анализ с определением пороговых значений и их операционных характеристик — диагностической чувствительности (ДЧ) и специфичности (ДС).
Результаты
Объекты (участники) исследования
Объектом исследования явились 67 пациентов с быстропрогрессирующим (грейд С, n = 19), хроническим простым (грейд В, n = 10) и хроническим сложным (при наличии окклюзионной травмы, грейд В, n = 38) пародонтитом и 15 условно здоровых пациентов (предимплантационные биопсии — группа контроля), которым было проведено клинико-инструментальное обследование и лечение с получением у каждого пациента информированного согласия. Патогистологическое исследование биопсийного материала десен пациентов с различными формами пародонтита не выявило статистически значимых различий между исследуемыми группами по оцениваемым признакам дистрофических изменений эпителия и собственной пластинки десны, состоянию коллагеновых волокон, наличию кровоизлияний, выраженности и составу воспалительной инфильтрации. Группы исследования были также сопоставимы по основным клинико-рентгенологическим параметрам за исключением данных панорамной и/или компьютерной томографии, при которой в группах быстропрогрессирующего и хронического сложного пародонтита статистически значимо чаще выявлялась вертикальная резорбция костной ткани I–II степени (р ≤ 0,005), а в группе хронического простого пародонтита преобладала горизонтальная резорбция I–II степени (р ≤ 0,05) (табл. 4).
Таблица 4. Общая клинико-рентгенологическая характеристика обследуемых групп пациентов с патологией пародонта
Признак* | БПП1, грейд С | ХПП2, грейд В | ХСП3, грейд В | p (χ2) |
Число пациентов | 19/67 (28) | 10/67 (15) | 38/67 (57) | |
Клинические признаки | ||||
Пародонтальные карманы, мм: • 4–5 • ≥ 6 | 12/19 (63) 7/19 (37) | 6/10 (60) 4/10 (40) | 25/38 (66) 13/38 (34) | NA NA |
Утеря прикрепления: • LA I • LA II | 13/19 (68) 6/19 (32) | 6/10 (60) 4/10 (40) | 26/38 (68) 12/38 (32) | NA NA |
Рецессия десны | 10/19 (53) | 6/10 (60) | 23/38 (61) | NA |
Поражение фуркации I–II степени | 3/19 (16) | 2/10 (20) | 7/38 (18) | NA |
Подвижность зубов I–II степени | 2/19 (11) | 1/10 (10) | 5/38 (13) | NA |
Данные панорамной рентгенографии и/или компьютерной томографии | ||||
Резорбция костной ткани I–II степени: • горизонтальная • вертикальная | 5/19 (26) 13/19 (68) | 7/10 (70) 1/10 (10) | 8/38 (21) 28/38 (74) | p1–2 = 0,046 p2–3 = 0,006 p1-2 = 0,005 p2–3 = 0,0004 |
Примечание. БПП — быстропрогрессирующий пародонтит; ХПП — хронический простой пародонтит; ХСП — хронический сложный пародонтит; * — показатели (номинативные данные — абсолютные числа и доли, %).
Основные результаты исследования
Экспрессия TIMP1 и TIMP2 выявлялась с вариабельной позитивностью и интенсивностью в как в эпителии, так и в строме десны при различных формах пародонтита и в группе предимплантационных биопсий (рис. 1, 2, табл. 5).
Рис. 1. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к TIMP1 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита (×200) (хромоген — DAB, контроокрашивание гематоксилином Майера) и результат работы алгоритма positive pixel count программы AperioImageScope: БПП — быстропрогрессирующий пародонтит; ХСП — хронический сложный пародонтит; ХПП — хронический простой пародонтит
Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита (×200) (хромоген — DAB, контроокрашивание гематоксилином Майера) и результат работы алгоритма positive pixel count программы AperioImageScope: БПП — быстропрогрессирующий пародонтит; ХСП — хронический сложный пародонтит; ХПП — хронический простой пародонтит
Имела место тенденция к повышению позитивности и интенсивности эпителиальной экспрессии TIMP1, а также интенсивности стромальной экспрессии данного маркера в направлении от предимплантационных биопсий (группы контроля) к хроническому простому пародонтиту (грейд В) с наибольшей экспрессией данного маркера в группах быстропрогрессирующего (грейд С) и хронического сложного (грейд В) пародонтита. Параметры общей экспрессии, а также позитивности стромальной экспрессии TIMP1 не имели отличий в группах контроля и хронического простого пародонтита (грейд В) и статистически значимо возрастали в группах быстропрогрессирующего (грейд С) и хронического сложного (грейд В) пародонтита. Характер экспрессии TIMP1 в группах с быстропрогрессирующим течением (грейд С) и хроническим сложным (грейд В) пародонтитом не имел значимых различий ни по одному из изученных параметров экспрессии TIMP1 (рис. 3, см. табл. 5).
Рис. 3. Характер экспрессии TIMP1 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита
Примечание. Медиана — круг; 25–75% — Мин–Макс; * — р < 0,05; ** — р < 0,001.
Таблица 5. Параметры экспрессии TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита
Контроль | БПП, грейд С | ХПП, грейд В | ХСП, грейд В | |
TIMP1 — Me (IQR) | ||||
eTIMP1_Positivity | 32 (8:57) | 84 (55:97) | 61 (38:82) | 83 (61:95) |
eTIMP1_Nsr+p | 0,4 (0,1:1) | 7,9 (0,9:88) | 2,16 (0,37:11,3) | 14 (2:53) |
eTIMP1_index | 210 (207:213) | 188 (144:208) | 198 (188:213) | 185 (167:200) |
eTIMP1_INDEX | 207 (205:211) | 188 (147:208) | 201 (185:210) | 185 (167:202) |
sTIMP1_Positivity | 5 (3:7) | 15 (6:44) | 4,5 (3:11,5) | 16 (8:31) |
sTIMP1_Nsr+p | 0,25 (0,1:0,5) | 4 (0,5:24) | 0,6 (0,07:2,99) | 3,5 (1,39:10,8) |
sTIMP1_index | 205 (202:207) | 188 (164:201) | 200 (188:208) | 187 (178:196) |
sTIMP1_INDEX | 201 (198:203) | 191 (169:199) | 197 (190:202) | 186 (177:196,5) |
allTIMP1_Positivity | 20 (5:32) | 49 (21:77,5) | 20,7 (12:26) | 42 (26:59) |
allTIMP1_Nsr+p | 0,6 (0,2:0,5) | 26 (0,5:60,1) | 1,66 (0,3:2,9) | 13 (1,1:13,8) |
allTIMP1_index | 209 (206:212) | 178 (141:207) | 204 (194:212) | 187 (179:203) |
allTIMP1_INDEX | 204 (201:206) | 178 (151:204) | 197 (188:205) | 186 (178:200) |
TIMP2 — Me (IQR) | ||||
eTIMP2_Positivity | 70 (35:87,5) | 98 (69,5:100) | 99 (96:100) | 94 (50:99) |
eTIMP2_Nsr+p | 5,1 (1,0:17,5) | 89,6 (4:98,8) | 97,8 (87:99,2) | 89,8 (27,4:98,7) |
eTIMP2_index | 196 (186:201) | 151 (127:200) | 129 (118:141) | 142 (120:165) |
eTIMP2_INDEX | 196 (188:202) | 151 (127:203) | 130 (118:141) | 143 (120:170) |
sTIMP2_Positivity | 15 (10:22) | 29,5 (10:57) | 42,5 (28,5:58,5) | 28,5 (9:53,5) |
sTIMP2_Nsr+p | 4 (1,7:7,2) | 15,2 (1,7:30,5) | 21,7 (12,6:34,1) | 14,1 (3,5:31,2) |
sTIMP2_index | 189 (182:193) | 169 (156:195) | 166 (154:175) | 167 (156:180) |
sTIMP2_INDEX | 193 (189:195) | 180 (167:198) | 175 (166:184) | 171 (161:179) |
allTIMP1_Positivity | 42 (16,5:59,5) | 60,3 (48:82) | 77 (73:82) | 54 (29,5:76,5) |
allTIMP1_Nsr+p | 10 (1,5:15,2) | 42,5 (2,9:69,2) | 64,8 (60:68) | 43,7 (20:66,7) |
allTIMP1_index | 192 (187:199) | 159 (131:201) | 134 (128:138) | 148 (131:162) |
allTIMP1_INDEX | 193 (188:199) | 165 (144:201) | 145 (140:149) | 153 (139:167) |
Результаты анализа экспрессии TIMP2 выявили похожие тенденции. Так, в группах пациентов с различным характером течения пародонтита отмечались значимо более высокие параметры позитивности и интенсивности экспрессии TIMP2 по сравнению с группой контроля (рис. 4, см. табл. 5). При этом уровни экспрессии возрастали в направлении от предимплантационных биопсий к быстропрогрессирующему (грейд С) и хроническому сложному (грейд В) пародонтиту и были наивысшими в группе пациентов с хроническим простым пародонтитом (грейд В), что подтверждается результатами парного сравнения групп.
Рис. 4. Характер экспрессии TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита
Примечание. Медиана – круг; 25–75% — Мин–Макс; * — р < 0,05; ** — р < 0,001.
Характер экспрессии TIMP2 в группах пациентов с быстропрогрессирующим (грейд С) и хроническим сложным (грейд В) пародонтитом не имел статистически значимых отличий по параметрам общей и стромальной позитивности экспрессии маркера. Одновременно в группе быстропрогрессирующего пародонтита (грейд С) отмечались более высокие параметры позитивности эпителиальной экспрессии TIMP2 и более низкие уровни интенсивности его общей, эпителиальной и стромальной экспрессии.
Выполненный ROC-анализ показал, что наиболее информативными параметрами экспрессии TIMP1 и TIMP2 в дифференциальной диагностике пародонтита, особенно на стадии манифестации заболевания, явились показатели общей и эпителиальной экспрессии:
- TIMР1 — позитивность и доля пикселей с высокой и умеренной интенсивностью общей экспрессии, позитивность эпителиальной экспрессии, общий индекс интенсивности и индекс общей интенсивности иммуногистохимической реакции в иммунопозитивных участках (рис. 5);
- TIMР2 — позитивность общей экспрессии, общий индекс интенсивности эпителиальной экспрессии и индекс интенсивности эпителиальной экспрессии в иммунопозитивных участках (рис. 6).
Рис. 5. Информативность показателей TIMP1 для дифференциальной диагностики быстропрогрессирующего (грейд С) с хроническими формами (грейд В) пародонтита
Рис. 6. Информативность показателей TIMP2 для дифференциальной диагностики быстропрогрессирующего (грейд С) с хроническими формами (грейд В) пародонтита
Проведенный корреляционный анализ параметров экспрессии TIMPs и изученных нами ранее MMPs [24] выявил обратную взаимосвязь параметров экспрессии TIMP1 с наиболее значимыми для быстропрогрессирующего течения пародонтита (грейд С) MMP1 (ρ = –0,40), ММР8 (ρ = –0,34), ММР13 (ρ = –0,46), ММР14 (ρ = –0,24) и прямую взаимосвязь с ММР9 (ρ = 0,37). Характер экспрессии TIMP2 также обратно коррелировал с таковым ММР8 (ρ = –0,41), ММР9 (ρ = –0,32) и имел прямую взаимосвязь с экспрессией MMP1 (ρ = 0,32), ММР2 (ρ = 0,37), ММР13 (ρ = 0,39), ММР14 (ρ = 0,36), р < 0,05.
Нежелательные явления
Нежелательные явления в ходе проведения исследования не отмечены.
Обсуждение
Несмотря на то что основной функцией TIMPs является ингибирование MMPs, они могут принимать участие в транспортировке и стабилизации MMPs, а экспрессия самих TIMPs может зависеть от спектра и уровней экспрессии MMPs, образуя очень сложную многоуровневую систему регуляции [12]. Увеличение при воспалении экспрессии MMPs и относительно более низкие уровни экспрессии TIMPs инициируют деградацию коллагена соединительной ткани пародонта и альвеолярного отростка кости. Большинство современных исследований в пародонтологии сконцентрировано на изучении MMPs и TIMPs в биологических жидкостях. Так, показано, что появление MMPs и TIMPs в слюне, десневой жидкости или сыворотке крови может свидетельствовать о прогрессировании заболевания [25], а избыточное количество продуктов распада коллагена в десневой жидкости и слюне может быть использовано для прогнозирования потери альвеолярной кости при пародонтите [26]. Преимуществом исследования биологических жидкостей является относительная простота и неизвазивность методов, а недостатком – невозможность с уверенностью исключить влияние на уровни MMPs и TIMPs системных заболеваний и некоторых нозологий местных заболеваний полости рта. В нашем исследовании анализ MMPs и TIMPs в бипсийном материале десны показывает истинные уровни их экспрессии и исключает неоднозначность трактовки полученных результатов.
Резюме основного результата исследования
В рамках проведенного исследования показаны особенности экспрессии TIMP1 и TIMP2 и их взаимосвязь с уровнями экспрессии MMPs в биопсийном материале десен пациентов с различными формами пародонтита, а также установлены диапазоны с «точками отсечения» параметров экспрессии изученных TIMPs для выделения группы пациентов с быстропрогрессирующим течением пародонтита уже на стадии манифестации заболевания.
Обсуждение основного результата исследования
Повышение уровней экспрессии TIMP1 и TIMP2 в биопсийном материале десен пациентов с патологией пародонта на фоне вариабельной экспрессии ингибируемых ими MMPs подтверждает роль данных биомолекулярных маркеров в развитии и скорости прогрессирования воспаления с дезорганизацией экстрацеллюлярного матрикса как тканей пародонта, так и альвеолярного отростка кости. При этом наиболее трудно дифференцируемый по клинико-рентгенологическим данным быстропрогрессирующий (грейд С) и хронический сложный (грейд В) пародонтит характеризовался практически сопоставимыми уровнями экспрессии изученных TIMPs, за исключением более высоких параметров позитивности эпителиальной экспрессии и более низкой интенсивности ее экспрессии TIMP2.
Аналогичных по дизайну исследований в литературе не обнаружено. Большинство из них касается в основном определения TIMPs в биологических жидкостях и имеет достаточно противоречивые результаты, в том числе об отсутствии различий [27, 28] и, наоборот, о более низких уровнях TIMP1 в слюне пациентов с пародонтитом (в целом или только хроническими формами) по сравнению со здоровыми людьми [29]. Результаты проведенного корреляционного анализа показали обратную взаимосвязь параметров экспрессии TIMPs с таковыми MMPs, в том числе с наиболее значимыми для развития быстропрогрессирующего характера течения пародонтита (грейд С) ММР1, ММР8 и ММР14, и согласуются с представлениями о патегенезе воспаления пародонта и данными других исследователей [30].
Также по-своему уникальными с точки зрения практического использования являются полученные параметры экспрессии TIMP1 и TIMP2 с целью классификации и определения скорости прогрессирования пародонтита на стадии первичной диагностики, среди которых наиболее информативны все изученные параметры общей экспрессии и позитивность эпителиальной экспрессии TIMP1, а также позитивность общей экспрессии и интенсивность эпителиальной экспрессии TIMP2.
Ограничения исследования
Немногочисленность групп обследования связана с относительно низкой частотой выявления отдельных форм патологии пародонта (в частности, быстропрогрессирующего пародонтита, грейд С), трудоемкостью и временными затратами на выполнение клинико-рентгенологических и морфологических исследований, а также стоимостью морфологического и иммуногистохимического исследования.
Заключение
Полученные нами результаты позволяют уточнить некоторые аспекты патогенеза различных форм пародонтита, что дополняет фундаментальные знания в данной области медицины и может способствовать совершенствованию подходов к таргетной регуляции активности изученных молекул, а также обладают прикладным значением в части использования параметра экспрессии TIMP1 и TIMP2 для выделения группы пациентов с быстропрогрессирующим характером течения пародонтита (грейд С) уже на стадии манифестации заболевания. Все это может способствовать максимально ранней индивидуализации лечения пациентов, особенно молодого возраста с быстропрогрессирующим течением пародонтита (грейд С), с целью предупреждения или замедления потери зубов, а также сохранения и/или улучшения качества жизни данной группы пациентов.
Дополнительная информация
Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках проекта «Разработать и внедрить метод диагностики быстропрогрессирующего периодонтита, основанный на определении в тканях периодонта матриксных металлопротеиназ» 2018–2020 № ГР 20180436 подпрограммы «Внутренние болезни» государственной научно-технической программы «Новые методы оказания медицинской помощи» 2016–2020.
Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.
Участие авторов. Л.А. Казеко — разработка цели, концепции и дизайна исследования, набор пациентов в группы, их обследование и лечение, написание текста и утверждение финальной версии рукописи; В.А. Захарова — согласование концепции и дизайна исследования, статистическая обработка, обобщение данных, критический анализ и корректировка текста рукописи, формата представления полученных результатов; Ю.Д. Бенеш — поиск публикаций по теме, перевод их на русский язык, морфометрический анализ гистологических изображений, написание текста рукописи; Е.Д. Черствый — согласование и утверждение концепции и дизайна исследования, критический анализ и корректировка текста рукописи, формата представления полученных результатов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
Об авторах
Людмила Анатольевна Казеко
Белорусский государственный медицинский университет
Автор, ответственный за переписку.
Email: 1kaf.terstom@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0821-0366
SPIN-код: 7607-7910
к.м.н., доцент
Белоруссия, МинскВиктория Алексеевна Захарова
Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова
Email: zakharava.vikt@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2050-9800
SPIN-код: 6638-7980
к.м.н., доцент
Белоруссия, ЛеснойЮлия Дмитриевна Бенеш
Белорусский государственный медицинский университет
Email: julia.benesh@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3207-9203
SPIN-код: 8744-8970
ассистент
Белоруссия, МинскЕвгений Давыдович Черствый
Белорусский государственный медицинский университет
Email: patanat@bsmu.by
ORCID iD: 0000-0002-2554-1431
SPIN-код: 1350-0976
д.м.н., профессор
Белоруссия, МинскСписок литературы
- Tatakis D, Kumar P. Etiology and Pathogenesis of Periodontal Diseases. Dent Clin North Am. 2005;49(3):491–516. doi: https://doi.org/10.1016/j.cden.2005.03.001
- Verma R, Hansch C. Matrix metalloproteinases (MMPs): Chemical–biological functions and (Q)SARs. Bioorg Med Chem. 2007;15(6):2223–2268. doi: https://doi.org/10.1016/j.bmc.2007.01.011
- Григоркевич О.С., Мокров Г.В., Косова Л.Ю. Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы // Фармакокинетика и фармакодинамика. — 2019. —№ 2. — С. 3–16. [Grigorkevich OS, Mokrov GV, Kosova LYu. Matrix metalloproteinases and their inhibitors. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2019;2:3–16. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.24411/2587-7836-2019-10040
- Gupta S. Quantitative structure-activity relationship studies on zinc-containing metalloproteinase inhibitors. Chem Rev. 2007;107(7):3042–3087. doi: https://doi.org/10.1021/cr030448t
- Maskos K. Crystal structures of MMPs in complex with physiological and pharmacological inhibitors. Biochimie. 2005;87(3–4):249–263. doi: https://doi.org/10.1016/j.biochi.2004.11.019
- Cathcart JM, Cao J. MMP Inhibitors Past present and future. Front Biosci (Landmark Ed). 2015;20(7):1164–1178. doi: https://doi.org/10.2741/4365
- Whittaker M, Ayscought A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors – current status and future challenges. Celltransmissions. 2001;17(1):3–14.
- Gomez DE, Alonso DF, Yoshiji H, et al. Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. Eur J Cell Biol. 1997;74(2):111–122.
- Herron GS, Banda MJ, Clark EJ et al. Secretion of metalloproteinases by stimulated capillary endothelial cells. II. Expression of collagenase and stromelysin activities is regulated by endogenous inhibitors. J Biol Chem. 1986;261(6):2814–2818.
- De Clerck Y, Yean TD, Ratzkin BJ, et al. Purification and characterization of two related but distinct metalloproteinase inhibitors secreted by bovine aortic endothelial cells. J Biol Chem. 1989;264(29):17445–17453.
- Kubota T, Matsuki Y, Nomura T, et al. In situ hybridization study on tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) mRNA-expressing cells in human inflamed gingival tissue. J Periodontal Res. 1997;32(5):467–472. doi: https://doi.org/10.1111/j.1600-0765.1997.tb00559.x
- Pavloff N, Staskus PW, Kishnani NS, etg al. A new inhibitor of metalloproteinases from chicken: ChIMP-3. A third member of the TIMP family. J Biol Chem. 1992;267(24):17321–17326.
- Apte S, Hayashi K, Seldin M, et al. Gene encoding a novel murine tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP), TIMP-3, is expressed in developing mouse epithelia, cartilage, and muscle, and is located on mouse chromosome 10. Dev Dyn. 1994;200(3):177–197. doi: https://doi.org/10.1002/aja.1002000302
- Greene J, Wang M, Liu YE, et al. Molecular cloning and characterization of human tissue inhibitor of metalloproteinase 4. J Biol Chem. 1996;271(48):30375–30380. doi: https://doi.org/10.1074/jbc.271.48.30375
- Bigg H, Shi Y, Liu Y, et al. Specific, high affinity binding of tissue inhibitor of metalloproteinases-4 (TIMP-4) to the COOH-terminal hemopexin-like domain of human gelatinase A. J Biol Chem. 1997;272(24):15496–15500. doi: https://doi.org/10.1074/jbc.272.24.15496
- Tokuhara C, Santesso M, Oliveira G, et al. Updating the role of matrix metalloproteinases in mineralized tissue and related diseases. J Appl Oral Sci. 2019;27:e20180596. doi: https://doi.org/10.1590/1678-7757-2018-0596
- Chang Y-Ch, Yang S-F, Lai Ch-Ch, et al. Regulation of matrix metalloproteinase production by cytokines, pharmacological agents and periodontal pathogens in human periodontal ligament fibroblast cultures. J Periodontal Res. 2002;37(3):196–203. doi: https://doi.org/10.1034/j.1600-0765.2002.00663.x
- Mouzakiti E, Pepelassi E, Fanourakis G, et al. Expression of MMPs and TIMP-1 in smoker and nonsmoker chronic periodontitis patients before and after periodontal treatment. J Periodontal Res. 2012;47(4):532–542. doi: https://doi.org/10.1111/j.1600-0765.2011.01465.x
- Rathnayake N, Åkerman S, Klinge B, et al. Salivary biomarkers of oral health — a cross-sectional study. J Clin Periodontol. 2012;40(2):140–147. doi: https://doi.org/10.1111/jcpe.12038
- Mattot V, Raes MB, Henriet P, et al. Expression of interstitial collagenase is restricted to skeletal tissue during mouse embryogenesis. J Cell Sci. 1995;108(2):529–535. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.108.2.529
- Chin JR, Werb Z. Matrix metalloproteinases regulate morphogenesis, migration and remodeling of epithelium, tongue skeletal muscle and cartilage in the mandibular arch. Development. 1997;124(8):1519–1530. doi: https://doi.org/10.1242/dev.124.8.1519
- Dew G, Murphy G, Stanton H, et al. Localisation of matrix metalloproteinases and TIMP-2 in resorbing mouse bone. Cell Tissue Res. 2000;299(3):385–394. doi: https://doi.org/10.1007/s004419900166
- Hatori K, Sasano Y, Takahashi I, et al. Osteoblasts and osteocytes express MMP2 and -8 and TIMP1, -2, and -3 along with extracellular matrix molecules during appositional bone formation. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 2004;277(2):262–271. doi: https://doi.org/10.1002/ar.a.20007
- Казеко Л.А., Захарова В.А., Анфиногенова Е.А., и др. Значение экспрессии матриксных металлопротеиназ в дифференциальной диагностике патологии пародонта // Архив патологии. — 2021. — Т. 83. — № 3. — С. 20–29. [Kazeko LA, Zakharava VA, Anfinogenova EA, et al. The significance of the expression of matrix metalloproteinases in the differential diagnosis of periodontal diseases. Arkhiv Patologii. 2021;83(3):20–29. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.17116/patol20218303120
- Soell M, Elkaim R, Tenenbaum H. Cathepsin C, matrix metalloproteinases, and their tissue inhibitors in gingiva and gingival crevicular fluid from periodontitis-affected patients. J Dent Res. 2002;81(3):174–178.
- Taba M, Kinney J, Kim A, et al. Diagnostic biomarkers for oral and periodontal diseases. Dent Clin North Am. 2005;49(3):551–571. doi: https://doi.org/10.1016/j.cden.2005.03.009
- Balogun AO, Taiwo JO, Opeodu OI, et al. Impact of Non-Surgical Periodontal Therapy on the Salivary Levels of Tissue Inhibitor of Metalloproteinse-1 (TIMP-1) in Patients with Chronic Periodontitis: A Third World Experience. Open Journal of Stomatology. 2021;11:197–207. doi: https://doi.org/10.4236/ojst.2021.115017
- de Brouwer P, Bikker FJ, Brand HS, et al. Is TIMP-1 a biomarker for periodontal disease? A systematic review and meta-analysis. J Periodont Res. 2021;57(2):235–245. doi: https://doi.org/10.1111/jre.12957
- Bostanci N., Mitsakakis K., Afacan B, et al. Validation and verification of predictive salivary biomarkers for oral health. Sci Rep. 2021;11(1):6406. doi: https://doi.org/10.1038/s41598-021-85120-w
- Pozo P, Valenzuela MA, Melej C, et al. Longitudinal analysis of metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases and clinical parameters in gingival crevicular fluid from periodontitis-affected patients. J Periodontal Res. 2005;40(3):199–207. doi: https://doi.org/10.1111/j.1600-0765.2005.00786.x
Дополнительные файлы
