The risk of sperm demage in men with the combined effect of endocrine disruptors

Full Text

Обоснование

Рост общего процента семей, страдающих бесплодием, а также низкое качество здоровья мужского населения являются тревожными знаками для перспективы будущего нации. «Критерий настороженности», установленный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), или доля бесплодных семей, составляет 15% от общего их числа. В Российской Федерации этот показатель еще больше — 17%. По мнению экспертов в сфере демографической политики, для прекращения процесса депопуляции в Российской Федерации необходимо чтобы суммарный коэффициент рождаемости на одну женщину репродуктивного возраста составлял 2,1, который в настоящее время не превышает 1,7 [1, 2]. Устранение сложившегося дисбаланса неразрывно связано с необходимостью решения проблемы патологии репродуктивной системы, к которой относится не только бесплодие, но и невынашивание беременности. С медицинской точки зрения, уникальность этих патологических состояний связана с тем, что они являются результатом взаимодействия мужского и женского факторов ― двух половых партнеров, состояние здоровья каждого из которых оказывает свое влияние на результат ― появление на свет здорового потомства.

Причины и механизмы невынашивания беременности остаются малоизученными, о чем свидетельствует значительная доля (до 40%) невынашивания с неизвестной причиной [2]. Вместе с тем, если материнские и плодовые факторы изучаются достаточно интенсивно, то оценке вклада мужского фактора как причины репродуктивных потерь и невынашивания беременности посвящен весьма ограниченный круг исследований. Анализируя репродуктивные потери, связанные с мужским фактором, следует иметь в виду, что морфофункциональные нарушения сперматозоидов на субклеточном уровне, нередко не выявляемые при стандартном исследовании эякулята, сопровождаются после оплодотворения достоверно большей эмбриональной смертностью и увеличением процента аномалий внутриутробного развития. В связи с этим значение сперматозоидов — не только в доставке генетического материала к яйцеклетке и индукции формирования яйцеклетки и зиготы, но и в поддержании развития зародыша на протяжении первых этапов беременности [3].

Наиболее частым ультраструктурным изменением сперматозоидов является фрагментация ядерной ДНК, представленная одно-/двухцепочечными разрывами молекулы ДНК. Многие авторы считают, что повреждения ДНК сперматозоидов могут служить диагностическим маркером негативного отцовского эффекта в предымплантационный период развития человека [4−8]. Ряд исследований [1, 3, 9, 10] показал прямую зависимость высокого процента повреждений ДНК сперматозоидов с частотой спонтанных абортов. Так, при наличии фрагментации ДНК сперматозоидов выше 30% прогнозируется практически нулевая вероятность оплодотворения при внутриматочной инсеминации [1]. M. Eisenberg и соавт., проанализировав потерю одноплодной беременности в 98 парах с позиции мужского фактора (количество и концентрация сперматозоидов, их подвижность и морфология, а также степень фрагментации ДНК сперматозоидов), пришли к выводу, что стандартные показатели спермограммы мало связаны с риском невынашивания беременности на популяционном уровне. Вместе с этим степень ДНК-фрагментации сперматозоидов ≥30% показала статистически значимую связь с невынашиванием беременности [6]. В настоящее время в литературе обсуждаются три основные теории, объясняющие повреждение генетического материала, ― неполный (абортивный) апоптоз, дефект созревания хроматина и оксидативный стресс. С другой стороны, известно, что повреждающее действие ксенобиотиков (эндокринных дизрапторов, EDs) на организм человека, например триклозана (triclosan, TCS) и бисфенола А (bisphenol A, ВРА), обусловлено их способностью индуцировать окислительный стресс [11, 12], лежащий в основе фрагментации ДНК сперматозоидов [13]. Влияние триклозана и бисфенола А на ДНК клеток, в том числе сперматозоидов, показано в некоторых работах [14−16].

Цель исследования ― оценить риск фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин при совместном влиянии бисфенола А, триклозана и 4-нонилфенола (4-Nonylphenol, 4-NP) в семенной жидкости.

Методы

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одноцентровое одномоментное (поперечное) неконтролируемое исследование.

Критерии соответствия

Критерии включения в исследование:

• мужчины в возрасте 22−40 лет;
• наличие бесплодия неустановленного генеза c патозооспермией;
• репродуктивные потери в супружеской паре с патозооспермией;
• планирование беременности в супружеской паре с нормозооспермией;
• доноры спермы;
• подписанное информированное добровольное согласие на включение в данное исследование.

Критерии исключения из исследования:

• варикоцеле;
• инфекции урогенитального тракта;
• лейкоспермия;
• МАР-тест (mixed antiglobulin reaction — смешанный антиглобулиновый тест) >10%;
• азооспермия;
• гипогонадизм и другие эндокринные заболевания;
• онкологические заболевания любой локализации;
• системные заболевания;
• неподписанное информированное добровольное согласие на включение в данное исследование.

Условия проведения

Набор пациентов производился во время амбулаторного приема на базе ДНК Клиники (Центр лечения бесплодия, Челябинск) среди мужчин, обратившихся за консультативной помощью с целью выполнения спермиологического исследования в связи с бесплодием в браке, невынашиванием беременности партнершей, а также планированием беременности или донорством спермы. Все пациенты проживали в Челябинске или Челябинской области.

Продолжительность исследования

Исследование проводилось с ноября 2017 по октябрь 2018 г.

Описание медицинского вмешательства

Всем пациентам проводился спермиологический анализ. Эякулят собирался после 3−4 дней воздержания от семяизвержений. Для оценки уровня репродуктивных гормонов осуществляли забор крови утром натощак до 9 ч. С целью проведения исследования на инфекцию урогенитального тракта осуществлялся забор материала из уретры минимум через 3 ч с момента последнего мочеиспускания. Для исключения патологии органов мошонки (варикоцеле, микролитиаз яичек и др.) всем участникам было выполнено ультразвуковое исследование органов мошонки.

Исходы исследования

Основной исход исследования: в работе оценивалось совместное влияние BPA, TCS и 4-NP, измеренных в семенной жидкости, на повреждение ДНК сперматозоидов. Вместе с этим определялся вклад каждого эндокринного дизраптора в развитие ДНК-фрагментации сперматозоидов при фиксированном значении концентрации остальных EDs (endocrine disruptors).

Анализ в подгруппах

При оценке качества 84 образцов эякулята пациенты были разделены на две группы: 1-я группа была представлена пациентами с нормозооспермией (n=36), 2-я группа — с патозооспермией (n=48). Для проведения сравнительного анализа пациенты были разделены по степени фрагментации ДНК сперматозоидов на две группы: в 1-й группе пациентов ДНК-фрагментация сперматозоидов <15% (n=18), во 2-й — ≥15% (n=29).

Методы регистрации исходов

Спермиологическое исследование проводилось согласно рекомендациям ВОЗ (2010) с оценкой общего количества, концентрации, подвижности, морфологии нормальных форм сперматозоидов по Крюгеру и степени фрагментации ДНК сперматозоидов. Заключение по спермограмме «Нормозооспермия» или «Патозооспермия» основывалось на критериях, изложенных в тех же рекомендациях ВОЗ (2010) [17]. Для оценки индекса фрагментации ДНК сперматозоидов использовался метод дисперсии хроматина спермы (sperm chromatin dispersion, SCD) с помощью набора GoldCyto DNA Assist Kit (MTM Laboratories AG, Германия). Нормативным значением степени фрагментации ДНК сперматозоидов считали менее 15% (низкий риск нарушения фертильности и невынашивания беременности). Эндокринные дизрапторы в семенной жидкости определяли на газовом хроматографе с масс-спектрометром Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Япония). Данные обрабатывались с помощью программы GCMSsolution 4,3 (Shimadzu Corporation, Япония). Оценка уровня репродуктивных гормонов крови проводилась на приборе Immulite 1000 (США). Ультразвуковое исследование органов мошонки выполняли на аппарате Mindray DC-7 (Китай) в положениях пациента лежа и стоя во время андрологического приема.

Этическая экспертиза

Проведение исследования одобрено 21.11.2017 г. Локальным комитетом по этике ФГБОУ ВО «ЮУГМУ» Минздрава, выписка из протокола № 9.

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался. Статистический анализ полученных данных выполнялся с помощью программы IBM SPSS Statistics v.21 (IBM Corp., Armonk, NY, США). Проверка нормальности распределения переменных проводилась с учетом объема выборки с использованием критерия Колмогорова–Смирнова или Шапиро–Уилка. Результаты исследования представлены как медиана с интерквартильным размахом Me (Q₁−Q₃) или как средняя со стандартным отклонением (M±σ) при нормальном распределении выборки. Для определения статистически значимых различий между группами использовался U-критерий Манна–Уитни. Для построения прогностической модели совместного влияния эндокринных дизрапторов (ВРА, TCS и 4-NP) на риск развития повышенной степени фрагментации ДНК сперматозоидов и оценки отношения шансов (ОШ) для каждого эндокринного дизраптора использовался метод множественной логистической регрессии. Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05 и/или отсутствии единицы в доверительном интервале (ДИ) при расчете ОШ.

Результаты

Объекты (участники) исследования

Из 84 пациентов, которые приняли участие в исследовании, 36 (43%) мужчин были с нормозооспермией, планирующие беременность в браке, или доноры спермы и 48 (57%) — с идиопатической формой бесплодия и/или репродуктивными потерями в супружеской паре с различными вариантами патозооспермии. В группах сравнения, разделенных по степени фрагментации ДНК сперматозоидов, средний возраст пациентов (±σ) составил 30,8±3,9 года, средний индекс массы тела (ИМТ± σ) ― 24,3±2,8 кг/м², при этом 42% мужчин были с избыточной массой тела (ИМТ 25−30) и 10% ― с ожирением 1-й степени (ИМТ >30).

Группы сравнительного анализа были сопоставимы по возрасту, периоду воздержания от семяизвержений, ИМТ, курению и приему алкоголя (табл. 1). При этом частота фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15% среди курящих и употребляющих алкоголь составила 72,7 и 68,7% соответственно, среди некурящих и неупотребляющих алкоголь ― 65,2 и 75,0%.

 

Таблица 1. Сопоставление групп по возрасту, ИМТ, периоду воздержания, статусу курения и употребления алкоголя

Параметры		1-я группа, n=18 ИФ ДНК <15%	2-я группа, n=29 ИФ ДНК ≥15%	р
Возраст, лет, M±σ		31,9±3,2	30,8±3,4	0,249
ИМТ, кг/м2, M±σ		24,6±2,4	26,0±3,0	0,176
Период воздержания, сут Me (Q1–Q3)		4,0 (3,0–4,0)	4,0 (3,0–4,0)	1,0
Курение (%)	Некурящие	8 (34,8)	15 (65,2)	1,0
	Курящие	3 (27,3)	8 (72,7)
Алкоголь (%)	Непьющие	4 (25,0)	12 (75,0)	1,0
	Пьющие	5 (31,3)	11 (68,7)
Концентрация ВРА, нг/мл Me (Q1–Q3)		0,06 (0,04–0,15)	0,18 (0,11–0,31)	0,014
Концентрация TCS, нг/мл Me (Q1–Q3)		0,08 (0,0–0,10)	0,19 (0,13–0,32)	<0,001
Концентрация 4-NP, нг/мл Me (Q1–Q3)		0,20 (0,10–0,30)	0,14 (0,06–0,42)	0,900

Примечание. ИМТ ― индекс массы тела, ИФ — индекс фрагментации ДНК сперматозоидов.

 

Основные результаты исследования

ВРА, TCS и 4-NP были обнаружены в 100; 84,3 и 98,1% образцов эякулята соответственно со срединной концентрацией 0,150 (0,06−0,29); 0,11 (0,05–0,21) и 0,16 (0,06–0,40) нг/мл соответственно. Варианты патозооспермии (57%) были представлены следующим образом: частота встречаемости тератозооспермии ― 28,6% (n=24), астенотератозооспермии ― 14,3% (n=12), олиготератозооспермии ― 8,3% (n=7), олигоастенозооспермии ― 2,4% (n=2), олигоастенотератозооспермии (ОАТ-синдром) ― 3,6% (n=3) (рис. 1).

 

Рис. 1. Доля нормозооспермии и различных вариантов патозооспермии (%)

Примечание. ОАТ — олигоастенотератозооспермия (ОАТ-синдром).

 

Группы пациентов, включенные в сравнительный анализ, статистически значимо различались по концентрации ВРА и TCS в семенной жидкости. Так, у мужчин с фрагментацией ДНК сперматозоидов ≥15% концентрация ВРА и TCS в семенной жидкости оказалась выше, а концентрация 4-NP — ниже, хотя различия оказались статистически незначимыми (см. табл. 1; рис. 2).

 

Рис. 2. Сравнение групп по концентрации EDs (нг/мл) в семенной жидкости

 

С целью оценки совместного влияния эндокринных дизрапторов (ВРА, TCS и 4-NP) на высокий риск фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15%, которая ассоциирована со снижением фертильности сперматозоидов и невынашиванием беременности в супружеской паре по мужскому фактору, мы использовали метод множественного регрессионного анализа. Наблюдаемая зависимость может быть описана следующим уравнением:

 

$p=\frac{1}{1+e^{-z}}, z=-1,01+2,75\mathrm{BPA}+10,71\mathrm{TCS}-1,37\mathrm{NP}$

 

где p ― вероятность наличия ДНК-фрагментации ≥15%; е (экспонента) ― постоянная, приблизительно равная 2,7; z ― мера полного вклада всех факторов риска (BPA, TCS и 4-NP), используемых в прогностической модели; ВРА ― концентрация бисфенола А в семенной жидкости (нг/мл); TCS ― концентрация триклозана в семенной жидкости (нг/мл); 4-NP ― концентрация 4-нонилфенола в семенной жидкости (нг/мл).

Исходя из значений регрессионных коэффициентов, факторы ВРА и TCS имеют прямую связь с вероятностью развития степени фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15%, а 4-NP — обратную связь.

Полученная регрессионная модель является статистически значимой (p=0,005). Однако в данном уравнении только коэффициент регрессии для TCS оказался статистически значимым (табл. 2). Исходя из значения коэффициента детерминации Найджелкерка, модель учитывает 38,7% факторов, определяющих вероятность развития нарушения фертильности и невынашивания беременности в супружеской паре по ДНК-фрагментации сперматозоидов. Модель считается информативной, если коэффициент детерминации больше 0,5. Диагностическая эффективность модели составила 80% с чувствительностью 62% и специфичностью 89%. Таким образом, можно предположить отсутствие синергического эффекта для данных EDs.

 

Таблица 2. Отношение шансов развития ДНК-фрагментации ≥15% при влиянии эндокринных дизрапторов в семенной жидкости

Переменная в модели	Регрессионные коэффициенты (B)	Стандартная ошибка B	Значимость коэффициента регрессии, p	ОШ	95% ДИ для ОШ
					Нижняя граница	Верхняя граница
NP	-1,373	2,412	0,569	0,253	0,002	28,624
TCS	10,711	5,282	0,043*	44824,281	1,430	1405164955,017
BPA	2,754	2,511	0,273	15,710	0,114	2156,712
Константа	-1,013	0,804	0,207	0,363	-	-

Примечание.* ― cвязь статистически значимая (р<0,05).

 

ОШ позволяет оценить шанс развития степени фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15% при изменении концентрации одного из дизрапторов на единицу с фиксацией остальных переменных модели. Так как изменение концентрации данных EDs на единицу очень значительно, то значения ОШ очень велики. В связи с этим шаг изменения концентрации фенольных соединений выбран в 0,1 нг/мл. Так, при увеличении концентрации TCS в семенной жидкости на 0,1 нг/мл при фиксации концентрации других дизрапторов шанс развития повышенной ДНК-фрагментации сперматозоидов возрастает в 2,9 раза (e^0,1•10,711). Данный фактор оказался статистически значимым (ДИ для ОШ не включает единицы). При увеличении концентрации ВРА в семенной жидкости на 0,1 нг/мл при фиксации концентрации других дизрапторов шанс развития повышенной ДНК-фрагментации сперматозоидов возрастает только в 1,3 раза (e^0,1•2,754), при этом 95% ДИ 0,11−2156,71 для ОШ включает единицу (фактор статистически незначим). С увеличением концентрации 4-NP в семенной жидкости на 0,1 нг/мл шанс развития ДНК-фрагментации сперматозоидов ≥15% снижается (e^0,1•1,373), т.к. ОШ 0,87; 95% ДИ 0,0−28,62, при этом доверительный интервал для ОШ также включает единицу (см. табл. 2).

Нежелательные явления

Нежелательных явлений не наблюдалось.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

В данном исследовании построена прогностическая модель совместного влияния эндокринных дизрапторов (ВРА, TCS и 4-NP) в семенной жидкости на риск развития степени фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15% с оценкой вклада каждого эндокринного дизраптора в исход (патологию).

Обсуждение основного результата исследования

Полученные результаты позволяют предположить, что риск развития степени фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15% связан в первую очередь с действием TCS в семенной жидкости, а не с действием бисфенола А и 4-NP, а также отсутствием синергического эффекта данных фенольных соединений на повреждение ДНК сперматозоидов. Интересно отметить, что влияние бисфенола А и триклозана, с одной стороны, и 4-нонилфенола — с другой на риск повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов оказалось разнонаправленным и неодинаковым по силе. Так, в случае ВРА и TCS связь с повреждением ДНК была прямой, а в случае с 4-NP — оказалась обратной. Можно предположить, что 4-нонилфенол, обнаруживаемый в семенной жидкости в интервале концентраций 0,06–0,40 нг/мл (Q1–Q3), будет иметь обратную связь с ДНК-фрагментацией ≥15%, другими словами, играть некую «протективную роль».

Известно, что организм человека одновременно подвержен воздействию смеси десятков или даже сотен EDs (коэргизм ксенобиотиков, «токсический коктейль») в разных дозах и в разные периоды жизни, включая самые ранние и самые чувствительные периоды развития. В одних случаях обнаруживается взаимопотенцирующий эффект, в других ― его ослабление вследствие антагонизма отдельных ксенобиотиков [18−20]. Вместе с тем понятно, что даже чрезвычайно малые дозы EDs могут приводить к биологическим изменениям, а последствия воздействия малых доз EDs нельзя экстраполировать на ситуацию с воздействием больших доз EDs на организм, и наоборот. Так, W. Zhu и соавт. [21], изучая влияние триклозана в моче на качество эякулята у мужчин, показали статистически значимую связь между концентрацией TCS в нижнем квартиле с параметрами спермы при отсутствии такой связи со средним и верхним квартилями.

В связи с этим выдвигается гипотеза о немонотонном ответе на дозу EDs (NMDR, non-monotonic dose-response): это означает, что ответ (негативный) не всегда повышается/снижается при повышении/снижении дозы и имеет форму U-образной или перевернутой U-образной кривой [20, 22]. Отсутствие так называемой безопасной дозы воздействия EDs необходимо иметь в виду при установлении связи между влиянием EDs и возникновением заболеваний или функциональных дисбалансов, что представляется более корректным в противовес связыванию начала болезни с воздействием одного конкретного ксенобиотика в определенной дозе.

Ограничения исследования

Основным фактором, который может значимо повлиять на результаты данного исследования, является влияние на репродуктивное здоровье мужчин других эндокринных дизрапторов (фталатов, тяжелых металлов, бензапирена и др.), а также сравнительно высокая общая токсическая нагрузка на исследуемых пациентов. Следует отметить, что недостаточный объем выборки пациентов, которым проводили исследование по измерению ВРА, TCS и 4-NP в семенной жидкости, связан с трудоемкостью и финансовой затратностью данного исследования.

Заключение

Влияние изучаемых эндокринных дизрапторов может иметь прямую, как в случае с TCS и ВРА, и обратную при воздействии 4-NP зависимость с патологическим процессом (степень фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15%), что, вероятно, связано в том числе с концентрацией ксенобиотика в тканях организма. Риск развития повышенной ДНК-фрагментации у мужчин в первую очередь связан с влиянием триклозана в семенной жидкости, а не других фенольных соединений (бисфенола А и 4-нонилфенола). Вместе с этим следует предположить отсутствие синергического эффекта бисфенола А, триклозана и 4-нонилфенола на повреждение ДНК сперматозоидов у мужчин.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Проведенное исследование выполнено на собственные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов: все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Выражение признательности. Авторы статьи выражают слова благодарности руководителю службы качества ООО «ХромсистемсЛаб» (Москва) Золкиной Ирине Вячеславовне за организацию и проведение исследования по детекции бисфенола А, триклозана и 4-нонилфенола в семенной жидкости методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией.

About the authors

Stanislav V. Chigrinets

South-Ural State Medical University of Russian Ministry of Health; DNK Clinic

Author for correspondence.
Email: chigrinstas@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7072-8289
SPIN-code: 2278-8992

graduate student of the Department of Histology, Embryology and Cytology; doctor o f the infertility treatment center 

Russian Federation, 64, Vorovsky street, Chelyabinsk, 454092; Chelyabinsk

Gennadiy V. Brukhin

South-Ural State Medical University of Russian Ministry of Health

Email: bgenvas@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3898-766X
SPIN-code: 7691-8383

MD, PhD, Professor

Russian Federation, 64, Vorovsky street, Chelyabinsk, 454092

References

Supplementary files