Genetic and epigenetic predictors of tongue squamous cell carcinoma sensitivity to platinum drugs

Full Text

Обоснование

В структуре онкологической заболеваемости в Российской Федерации злокачественные опухоли полости рта составляют 30,8 на 100 тыс. человек [1]. Рак языка среди злокачественных опухолей полости рта занимает 1-е место [2]. Несмотря на доступность клиническому осмотру и хорошую визуализацию этой области, большая часть (70–80%) пациентов поступает на лечение в III и IV стадиях заболевания. Поздняя диагностика обусловливает высокий процент развития рецидивов, практически при каждом втором случае, что повышает показатель смертности в течение 1-го года с момента установления диагноза злокачественного новообразования языка [3]. Опухоли данной локализации характеризуются ранним инфильтративным ростом и частым метастазированием в региональные лимфатические узлы [4]. В 2021 г. в мире рак ротовой полости привел к более 135 тыс. летальных случаев (GBD 2021 Mortality Causes of Death Collaborators, 2022). В России, по данным 2018 г., заболеваемость раком полости рта составляет 26 случаев на 100 тыс. населения, что на 11,5% выше по сравнению с 2011 г.

В настоящее время, согласно практическим рекомендациям RUSSCO, стандартным подходом лечения местно-распространенных форм рака языка являются хирургическое лечение, лучевая терапия и/или химиотерапия [4]. Лечение местно-распространенных злокачественных опухолей головы и шеи, заключающееся в использовании хирургического, лучевого методов, химиотерапии и их комбинаций, представляет чрезвычайно сложную и ответственную задачу [5]. Основным этапом в комбинированном и комплексном лечении рака органов головы и шеи является хирургический. Поиски путей улучшения результатов лечения больных со злокачественными опухолями органов головы и шеи привели к использованию на различных этапах лечебного процесса лекарственных противоопухолевых средств. Однако попытки улучшить результаты лечения рака языка за счет только индукционной химио/химиолучевой терапии оказались малоэффективны. Очевидно, что в отношении этих опухолей следует вести более агрессивную тактику лечения [6]. Необходима разработка новых способов лечения рака языка, учитывающих молекулярно-генетические характеристики опухоли, особенно в отношении определения ее чувствительности к применяемым химиотерапевтическим средствам.

Цель настоящего исследования — скрининг генетических и эпигенетических предикторов чувствительности местно-распространенного рака языка к терапии препаратами платины.

Методы

Работа выполнена в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России за период с 2017 по 2022 г. Проанализированы данные комплексного клинического и молекулярно-генетического обследования 130 больных с местно-распространенными злокачественными опухолями языка, а также 30 добровольцев без онкологической патологии (группа условно здоровых добровольцев).

Дизайн исследования

В исследовании использован новый способ лечения местно-распространенного плоскоклеточного рака языка с использованием двухтапной суперселективной эмболизации в качестве компонента комплексного лечения. Данный способ позволит усилить воздействие противоопухолевого препарата цисплатина на опухоль и перитуморальную зону, что даст возможность сократить объем опухоли и обеспечить оптимальную радикальность оперативного лечения, а также уменьшить кровопотерю во время хирургического вмешательства.

В качестве объектов исследования нами выбраны следующие группы пациентов:

1. основная — 100 больных с впервые установленным диагнозом плоскоклеточного рака языка III, IV стадий, которым проведено лечение по указанному выше способу;
2. условно здоровых добровольцев — 30 человек без онкологической патологии.

На первом этапе лечения проводилось рентген-эндоваскулярное вмешательство в следующем объеме: масляная химиоэмболизация сосудов опухоли языка противоопухолевым препаратом (цисплатин в дозе 100 мг/м²). Через 7–10 дней, после реализации эффекта химиопрепарата, осуществлялась эмболизация сосудов опухоли микроспиралями. На следующий день после эмболизации проводилось хирургическое лечение в объеме, адекватном распространенности опухоли. Адъювантная лучевая терапия выполнялась в стандартном режиме.

Для 50 больных основной группы показана высокая чувствительность к проводимой терапии, еще для 50 пациентов клинически значимый эффект от применения цисплатина не был установлен.

Чувствительность к терапии цисплатином оценивалась по изменению клинической симптоматики (уменьшение боли и ихорозного запаха) и размеров опухоли (оценивался процент регрессии опухоли). Процент регрессии определяли при выполнении СРКТ после проведения терапии. Чувствительными к проводимой терапии считали пациентов, у которых наблюдались частичная регрессия опухоли и уменьшение клинической симптоматики. Резистентными к проводимой терапии считали пациентов, у которых наблюдались стабилизация или прогрессирование опухолевого процесса на фоне значительного усиления клинической симптоматики. Дизайн исследования представлен на рис. 1.

 

Рис. 1. Дизайн исследования

 

Критерии включения: первичный резектабельный рак языка (Т2-4N0-2M0) без предшествующего лечения; возраст старше 18 лет; морфологическая верификация опухоли; наличие информированного добровольного согласия на участие в исследовании.

Критерии невключения: отказ больного от участия в исследовании.

Критерии исключения: отзыв информированного согласия.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе отделения опухолей головы и шеи и лаборатории молекулярной онкологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России.

Этическая экспертиза

Протокол от 24 января 2017 г. № 6/1 заседания этического комитета ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России.

Биоинформатический анализ данных

Набор данных экспрессии генов был загружен с GEO (Gene Expression Omnibus) и содержал информацию по 15 образцам плоскоклеточного рака языка и 15 нормальным тканям языка (характеристики пациентов представлены в приложении).

Идентификацию дифференциально-экспрессирующихся генов (ДЭГ, DEG) между злокачественными и незлокачественными тканями осуществляли с помощью GEO2R. Исчерпывающий набор функциональных аннотаций предоставлен базой данных DAVID. Сеть PPI DEG была построена с использованием онлайн-базы данных Search Tool for the Retrieval of Intecting Genes (STRING). Гены-концентраторы были отобраны с помощью программного обеспечения Cytoscape.

Набор данных из Genomic Data Commons Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/) содержал информацию по образцам 156 пациентов (характеристики пациентов представлены в приложении). Для получения данных использовали пакет TCGABiolinks языка R v. 4.0.0 в оболочке Rstudio. Для идентификации областей генома, размер которых значительно увеличивался или уменьшался в ряде образцов опухолей, применяли алгоритмы GISTIC версии 2.0.22, MutSig и RAE [7].

Перечень дифференциально-экспрессирующихся генов сравнивался с данными по копийности. Коррекция на групповой эффект (batch effect) осуществлялась с помощью пакета SVA (язык R). В экспериментальную часть работы были включены только локусы, имеющие сонаправленные изменения экспрессии и копийности.

Определение показателя относительной копийности

Материалом для исследования послужили биопсийные образцы тканей 100 пациентов. Экстракция образцов ДНК была выполнена с использованием набора реактивов «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», Россия) согласно инструкции производителя. Для определения относительной копийности генов с использованием базы данных NCBI GenBank были разработаны последовательности 68 пар синтетических олигонуклеотидов (праймеров, прямых и обратных), включая 3 пары для референсных локусов (ACTB, B2M, GAPDH).

Определение относительной копийности генетических локусов проводили методом Real-Time qPCR с флуоресцентным красителем EVA-Green. Амплификация каждой пробы осуществлялась в трех повторах. Усредненные данные по каждому генетическому локусу нормировались по усредненному показателю референсных генов для получения величины ΔC_t:

ΔC_t = C_t (среднее исследуемого гена) – C_t (среднее геометрическое референсных генов).

Копийность генетического локуса (rC) рассчитывали по формуле

rC = Е^–ΔCt ,

где Е — эффективность амплификации, рассчитанная по формуле

E = 10^–1/k ,

где k — коэффициент из уравнения прямой C(T) = klog P₀ + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных; Е = 1,945.

Далее вычисляли медиану rC_оп для опухолевых образцов клеток и медиану rC_н для контрольных образцов по каждому генетическому локусу и рассчитывали кратность изменения (fold change, FC) копийности генов в опухолевых образцах по отношению к контрольным [8]:

FC = rC_{опухоль} / rC_норма = E^{–ΔCt(опухоль)} / E^{–ΔCt(контроль)}.

Определение показателя относительной копийности генов во внеклеточной ДНК (внДНК) плазмы крови

Для получения внДНК использовали кровь, взятую путем венопункции у 100 больных раком языка и у 30 доноров без онкологической патологии (контрольная группа). Плазму крови отделяли центрифугированием (30 мин, 2000 об/мин, t = 10 °С). Из плазмы выделяли внДНК фенол-хлороформным методом. Оценку показателя относительной копийности генов проводили методом количественной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) с флуоресцентным красителем EVA-Green. Разработка последовательности синтетических олигонуклеотидов (праймеров) осуществлялась с помощью Primer-BLAST и базы данных GenBank (NCBI). В качестве референсного гена для нормализации полученных показателей RT-qPCR был выбран GAPDH.

Относительную копийность (rC) рассчитывали по формуле, описанной Д.С. Кутилиным [8]:

rC = rC_о/rC_н = E^{–ΔCt(образцов от больных) :} : E^{-ΔCt(образцов от условно здоровых)},

где Е — эффективность ПЦР-амплификации, рассчитанная по формуле E = 10^–1/k, где k — коэффициент уравнения прямой C(T) = klog P₀ + b, полученной в ходе линейной аппроксимации данных экспериментальных постановок ПЦР; усредненное значение Е = 1,914; ΔC_t — разница между средним геометрическим C_t (гена-мишени) и средним геометрическим C_t (референсного гена) [8].

Оценка экспрессии генов

Выделение и очистку фракции тотальной РНК производили с помощью набора RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя. Для наработки кДНК готовили реакционную смесь, содержащую 5 мкМ рандомных праймеров, 1 × RT буфер, 0,5 мМ dNTP микс, 0,5 ед. акт./ мкл RNase Inhibitor, 5 U/ мкл ReverseTranscriptase ММLV. Методом количественной ПЦР в режиме реального времени RT-qPCR определяли величины относительной экспрессии генетических локусов. В качестве референсных после серии предварительных экспериментов использовали — GAPDH, ACTB и B2M. Полученные данные подвергали статистической обработке. Относительную экспрессию (RЕ) рассчитывали по формуле

RЕ = 2^–ΔΔCt.

Методы статистической обработки полученных данных

Cтатистическую обработку результатов выполняли с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, США). Для проведения кластерного анализа (Hierarchical Clustering, Euclidean distance) и построения тепловых карт использовали скрипты на языке R. Нормальность распределения показателей оценивали с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Оценку различий проводили с использованием критерия Манна–Уитни для порогового уровня статистической значимости р < 0,05, для учета множественного сравнения применяли поправку Бонферрони.

Для выявления общих сигнальных путей исследуемых генов использовали алгоритм «сетевой интеграции нескольких ассоциаций», который предсказывает функцию и положение гена в составе сложной сети из множества других генов, а также рассчитывает оценку (W-value) для каждой точки построенной сети, отражающую силу связи между соседними точками [9].

Для выбора минимальных наборов генов и построения предсказательных моделей использовали LASSO-пенализованную логистическую регрессию. Операции проводили при помощи языка программирования R (v. 4.0.1) в оболочке RStudio. Коэффициент регуляризации L1 определяли при помощи k-мерной кросс-валидации. Для предотвращения переобучения модели проводили оптимизацию L1 при помощи генерации 2000 повторных выборок методом bootstrap. В каждой выборке данные были случайно разделены на обучающую и тестовую группы. Эффективность модели, построенной на основе обучающей группы, оценивали на данных тестовой группы и записывали площадь под ROC-кривой и показатель Бриера. Оптимальным считали значение L1, соответствующее наименьшему значению показателя Бриера. Важность для каждой переменной определяли путем подсчета доли bootstrap-моделей, в которых эта переменная имела ненулевой коэффициент. Окончательную модель строили на основе всех данных, используя оптимальное значение L1.

Результаты

На первом этапе нашего исследования был использован и проанализирован набор данных из базы Gene Expression Omnibus (GEO) для получения перечня дифференциально экспрессирующихся генов (DEG) между тканями опухоли и незлокачественными тканями. Впоследствии был проведен анализ путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), анализ обогащения генной онтологии (GO) и сетевой анализ белок-белкового взаимодействия (PPI) для характеристики молекулярных механизмов, лежащих в основе канцерогенеза и прогрессирования данного типа опухолей. Всего было идентифицировано 648 дифференциально экспрессирующихся генов (рис. 2, А) и 26 узловых генов, которые могут быть потенциальными мишенями для клинической диагностики и терапии плоскоклеточного рака языка (рис. 2, Б).

 

Рис. 2. «Вулкан плот» и сеть PPI DEG: A — DEG были выбраны с кратным изменением ≥ 2 или ≤ –2 и скорректированным p-значением < 0,05. Зеленая точка показывает, что экспрессия гена в опухоли была вдвое меньше, чем в нормальных тканях, тогда как красная точка — что экспрессия гена в опухоли более чем в 2 раза выше относительно нормальных тканей (p < 0,05). Черные точки представляют гены, которые не считались дифференциально экспрессируемыми; Б — сеть PPI DEG была построена с использованием Cytoscape, PPI — белок-белковое взаимодействие, DEG — дифференциально экспрессируемые гены

 

Для анализа биологической классификации DEGs анализ обогащения путей GO и KEGG был выполнен с использованием DAVID (табл. 1). Результаты анализа GO показали, что изменения в биологических процессах ДЭГ в основном связаны с «процессами в мышечной системе», «организацией внеклеточного матрикса», «сокращением мышц», «организацией внеклеточной структуры» и «скольжением мышечных волокон». Молекулярные функции DEG включали «связывание актина», «связывание с цитоскелетным белком» и «связывание актинина». Анализ пути KEGG показал, что ДЭГ в основном обогащены «взаимодействием внеклеточного матрикса (ЕСМ) с рецептором», «очаговой адгезией», «метаболизмом лекарственного средства — цитохромом P450» и «химическим канцерогенезом».

 

Таблица 1. Анализ обогащения путей GO и KEGG ДЭГ при раке языка

	Описание	Число генов в наборе	p-значение
GO: 0003012	Процесс мышечной системы	54	1,63 × 10−19
GO: 0030198	Организация внеклеточного матрикса	49	1,86 × 10−19
GO: 0043062	Организация внеклеточной структуры	49	2,12 × 10 19
GO: 0006936	Сокращение мышц	48	7,41 × 10−19
GO: 0030049	Скольжение мышечной нити	19	7,21 × 10−18
GO: 0003779	Связывание актина	42	1,61 × 10−11
GO: 0008307	Структурная составляющая мышцы	15	1,63 × 10−11
GO: 0008092	Связывание с белками цитоскелета	63	2,75 × 10−10
GO: 0005198	Структурная активность молекулы	58	1,91 × 10−09
GO: 0042805	Связывание актинина	9	2,04 × 10−06
GO: 0044421	Часть внеклеточной области	233	1,75 × 10−23
GO: 0005576	Внеклеточная область	258	4,88 × 10−22
GO: 0043292	Сократительное волокно	45	9,81 × 10−22
GO: 0030017	Саркомер	41	3,45 × 10−21
GO: 0030016	Миофибриллы	43	6,08 × 10−21
hsa04512	ECM-рецепторное взаимодействие	18	8,56 × 10−10
hsa05146	Амебиаз	17	1,28 × 10−07
hsa04510	Очаговая адгезия	22	1,30 × 10−06
hsa00982	Метаболизм препарата-цитохром Р450	12	6,32 × 10 −06
hsa05204	Химический канцерогенез	12	3,11 × 10−05
hsa05414	Дилатационная кардиомиопатия	12	4,95 × 10−05
hsa05410	Гипертрофическая кардиомиопатия	11	1,31 × 10−04
hsa00830	Метаболизм ретинола	9	8,20 × 10−04

Примечание. GO — генная онтология; KEGG — Киотская энциклопедия генов и геномов; ДЭГ — дифференциально экспрессируемые гены.

 

Используя подключаемый модуль MCODE Cytoscape, 26 генов идентифицировано как гены-концентраторы. Результаты анализа путей GO и KEGG показали, что гены-концентраторы были в основном обогащены «организацией внеклеточного матрикса», «катаболическим процессом коллагена», «организацией внеклеточной структуры», «катаболическим процессом многоклеточного организма», «процессом метаболизма коллагена» и «каскадом комплемента и коагуляции». Сеть генов-концентраторов и их коэкспрессируемых генов анализировали с помощью cBioPortal for Cancer Genomics (рис. 3, A). Иерархическая кластеризация показала, что экспрессия генов-концентраторов может отличать образцы рака от нормальных образцов (рис. 3, Б). 22 из 26 генов-концентраторов было высокоэкспрессировано в опухолях по сравнению с нормальными тканями, тогда как экспрессия четырех генов (MMRN1/ECM1/EXCL12/CFD) была относительно высокой в нормальных тканях. Кроме того, иерархическая кластеризация показала, что статус инфекции ВПЧ (рис. 3, В) и P16 (рис. 3, Г) отрицательно связан с экспрессией гена, хотя механизмы остаются неизвестными.

 

Рис. 3. Анализ генов-концентраторов и их коэкспрессируемых генов, а также иерархическая кластеризация генов-концентраторов: A — гены-концентраторы и их коэкспрессируемые гены, проанализированные с помощью cBioPortal. Узлы с жирными черными контурами представляют собой гены-концентраторы, узлы с тонкими черными контурами — коэкспрессируемые гены. Цвет в круге представляет собой полное изменение гена в геномных профилях, включая повышенную и пониженную экспрессию. Интенсивность цвета указывает на большее изменение. Синяя стрелка обозначает изменение состояния; зеленая — контроль-экспрессии; Б — образцы, сгруппированные коричневой полосой, не являются злокачественными образцами, а образцы, сгруппированные синей полосой, являются образцами рака языка; В, Г — образцы, сгруппированные коричневой полосой, являются HPV-положительными образцами, а образцы, сгруппированные синей полосой, — HPV-отрицательными. Красный цвет указывает на активацию генов, а синий — на подавление активности генов

 

Общий анализ выживаемости был выполнен с использованием кривых Каплана–Мейера на онлайн-платформе cBioPortal. Пациенты с высокой экспрессией интерлейкина 8 (IL-8), IL-1B и члена 1 семейства серпинов (SERPINA1) имели худшую общую выживаемость и худшую выживаемость без заболевания. Oncomine анализ опухолевых тканей по сравнению с нормальными тканями показал, что IL-8, IL-1B и SERPINA1 были сверхэкспрессированы при раке. Более высокие уровни экспрессии мРНК IL-8 (p = 6,30 × 10^–9) и IL-1B (p = 3,48 × 10^–6) были связаны со статусом ВПЧ-инфекции HPV. Однако уровни экспрессии мРНК SERPINA1 не были связаны со статусом инфекции ВПЧ.

Ряд исследований показал, что ВПЧ-инфекция играет определенную роль в патогенезе опухолей головы и шеи [10]. Онкоминологический анализ рака продемонстрировал, что экспрессия мРНК IL-8, IL-1B и SERPINA1 была выше в группе HPV-отрицательных по сравнению с таковой в группе HPV-положительных [11]. В нашем исследовании набор данных проанализирован для получения дифференциально экспрессирующихся генов между опухолевыми и нормальными тканями. Кроме того, данные указывают на то, что ряд дифференциально экспресирующихся генов связан с сигнальными путями «химического канцерогенеза» и «лекарственного метаболизма», соответственно, может участвовать в чувствительности к химиотерапии.

Результаты анализа копийности генов с помощью алгоритма GISTIC2

В настоящее время накоплены значительные объемы данных о копийности генов в клетках опухолей, в том числе при плоскоклеточном раке языка. Чтобы подобрать перечень потенциальных молекулярных маркеров для оценки ответа этих опухолей на терапию, мы использовали данные проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA), которые были извлечены с портала Genomic Data Commons. Портал содержит информацию о мутациях, метилировании ДНК, транскриптоме, экспрессии микро-РНК и копийности генов в образцах тканей 156 пациентов с диагнозом «плоскоклеточный рак языка». GISTIC идентифицирует области генома, размер которых значительно увеличивается или уменьшается в ряде образцов опухолей. Конвейер сначала фильтрует нормальные образцы из сегментированных данных по копийности, проверяя коды TCGA, и затем выполняется GISTIC версии 2.0.22. В этом анализе было использовано 156 образцов опухолей и обнаружено 27 значимых результатов на уровне фрагментов хромосом, 28 значительных очаговых амплификаций и 48 значительных очаговых делеций. На рис. 4 изображено геномное положение амплифицированных и делецированных участков: на оси X представлены нормализованные уровни амплификации/ делеции (вверху) и значимость по Q-value (внизу). Зеленая линия устанавливает границу значимости при значении Q = 0,25. Проведен анализ связи между значительной изменчивостью числа копий генов в 76 участках хромосом и чувствительностью к препаратам платины. Для оценки статистической значимости использовали двусторонний точный критерий Фишера с применением функции fisher. test в языке R. По результатам анализа изменение копийности генов в двух хромосомных локусах — 11q23.1 и 14q32.32 — ассоциировано с чувствительностью к препаратам платины. В участке 11q23.1 гена снижают свою копийность 84 гена, в участке 14q32.32 — 282 гена.

 

Рис. 4. Геномное положение амплифицированных и делетированных областей

 

Кроме того, из базы CellMiner v. 2.5 были загружены данные по соединениям платины и транскриптому/копийности генов для линий раковых клеток. Для определения корреляции между чувствительностью к лекарственным препаратам платины и экспрессией/копийностью генов был проведен корреляционный анализ Спирмена (|cor| > 0,3; а также p-значение < 0,01). Интеграция наборов данных секвенирования РНК (RNA-seq), данных о вариациях числа копий (CNV) и соответствующей клинико-патологической информации из базы данных TCGA и Gene Expression Omnibus (GEO) позволила выделить ряд генетических локусов, ассоциированных с чувствительностью к терапии препаратами платины (цисплатином):

1. гены, отвечающих за репарацию ДНК, — BRCA1, BRCA2, BLM, NBS1, DDB1, ERCC1, ERCC2, ERCC4, ERCC5, OGG1, DMC1, BAP1, RAD17, TOP3A, RNF168, DNMT1, RAD21, EXO1, CDK7, MSH3, POLK, CCNO, ERCC8, ATAD5, XRCC4, RAD50, CCNH, FTO, PIAS1, TIPIN, PIF1, PARP1, HMGB2, LIG1, POLH, POLB и APTX;
2. гены, отвечающие за регуляцию апоптоза, — BAX, BCL2, CASP3, CASP8, P53, MDM2, TIAF1, TRAF4, MAP3K1, FOXD1, PML, PIK3R1, FOXI1, HSPA4, RASA1, PERP, DAPK2, HSPA6, TUBB4B, ERBB2, BNIP3, MCL1, MAGEH1, RHOB, BCL7C, RNF7, BCL2L10 и NGFRAP1.

Указанный перечень генов был валидирован в проведенной нами экспериментальной работе.

Экспериментальный скрининг молекулярно-генетических предикторов чувствительности опухолевых клеток языка к препаратам платины

До начала лечения брались образцы биопсии. В ДНК, выделенной из этих образцов, оценивали уровень копийности 65 генов — BRCA1, BRCA2, BLM, NBS1, DDB1, ERCC1, ERCC2, ERCC4, ERCC5, OGG1, DMC1, BAP1, RAD17, TOP3A, RNF168, DNMT1, RAD21, EXO1, CDK7, MSH3, POLK, CCNO, ERCC8, ATAD5, XRCC4, RAD50, CCNH, FTO, PIAS1, TIPIN, PIF1, PARP1, HMGB2, LIG1, POLH, POLB, APTX, BAX, BCL2, CASP3, CASP8, P53, MDM2, TIAF1, TRAF4, MAP3K1, FOXD1, PML, PIK3R1, FOXI1, HSPA4, RASA1, PERP, DAPK2, HSPA6, TUBB4B, ERBB2, BNIP3, MCL1, MAGEH1, RHOB, BCL7C, RNF7, BCL2L10 и NGFRAP1. Результаты по копийности генов в этих группах представлены на рис. 5.

 

Рис. 5. Показатель относительной копийности генов в образцах больных плоскоклеточным раком языка, чувствительных и резистентных к препаратам платины

Примечание. Статистически значимые отличия: * — от нормальной ткани (p < 0,01); ** — между двумя группами больных (p < 0,01).

 

Обнаружены статистически значимые (p < 0,01) отличия между образцами пациентов, чувствительных (группа 1) и резистентных (группа 2) к терапии, по копийности следующих генов: BRCA1 (в 3,2 раза выше в группе 2); BLM (в 6,3 раза выше в группе 2); NBS1 (в 5,2 раза выше в группе 2); ERCC1 (в 7,5 раза выше в группе 2); ERCC2 (в 5,0 раза выше в группе 2); EXO1 (в 3,0 раза выше в группе 2); RAD50 (в 3,6 раза выше в группе 2); PIF1 (в 4,7 раза выше в группе 2); LIG1 (в 13,0 раз выше в группе 2); BAX (в 2,8 раза ниже в группе 2); BCL2 (в 2,7 раз выше в группе 2); CASP3 (в 1,9 раз ниже в группе 2); CASP8 (в 2,6 раза ниже в группе 2); PML (в 2,1 раза ниже в группе 2); RASA1 (в 2,0 раза ниже в группе 2); ERBB2 (в 2,8 раза выше в группе 2); MAGEH1 (в 5,0 раз ниже в группе 2); NGFRAP1 (в 3,9 раза ниже в группе 2).

Таким образом, обнаружено отличие в копийности 18 генетических локусов между пациентами, чувствительными к терапии препаратами платины и резистентными к ней. Так, ген BLM кодирует геликазу, которая участвует в гомологичной рекомбинационной репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Ген NBS1 кодирует белок нибрин, также связанный с репарацией двухцепочечных разрывов, приводящих к значительному повреждению генетической информации. Этот белок — член NBS1/hMre11/Rad50 комплекса репарации двойных разрывов ДНК (более известного как MRN-комплекс). Этот комплекс опознает повреждение ДНК и быстро перемещаетcя в поврежденные сайты [12]. NBS1 сверхэкспрессируется при некоторых раковых заболеваниях — предстательной железы [13], головы и шеи [14, 15].

Ген ERCC1 кодирует белок эксцизионной репарации ДНК. Вместе с ERCC4 он образует ферментный комплекс ERCC1-XPF, который участвует в репарации и рекомбинации ДНК. Клетки с инвалидизирующими мутациями в ERCC1 более чувствительны, чем обычно, к определенным агентам, повреждающим ДНК, включая ультрафиолетовое излучение и химические вещества, вызывающие перекрестное связывание между цепями ДНК [16]. Продукт гена EXO1 взаимодействует с Msh2 и участвует в репарации и гомологичной рекомбинации ДНК [17].

Ген PIF1 кодирует ДНК-зависимый фермент, метаболизирующий аденозинтрифосфат, который функционирует как геликаза ДНК от 5’ до 3’. Кодируемый белок может разрушать структуры G-квадруплекса и гибриды РНК–ДНК на концах хромосом. Он также предотвращает удлинение теломер, ингибируя действие теломеразы. Ген LIG1 кодирует ДНК-лигазу I, которая участвует в репликации ДНК и процессе эксцизионной репарации оснований. ДНК-лигаза I выполняет функцию лигирования одноцепочечных разрывов ДНК на заключительном этапе эксцизионной репарации. Мутации в LIG1, приводящие к дефициту ДНК-лигазы I, обусловливают повышенную чувствительность к агентам, повреждающим ДНК [18]. Ген RAD50 кодирует белок, участвующий в репарации двойных разрывов цепочки ДНК. Этот белок образует комплекс с MRE11 и NBS1. Данный комплекс MRN связывается с поврежденными концами ДНК и представляет многочисленные ферментативные активности, необходимые для репарации двойных разрывов.

Ген PML кодирует белок — член семьи TRIM. Этот фосфопротеин локализуется в ядерных тельцах, где функционирует как фактор транскрипции и супрессор опухолевого роста. Его экспрессия приводит к остановке клеточного цикла и регулирует экспрессию P53 в ответ на онкогенные сигналы. Белок, кодируемый геном RASA1 (RAS P21 Protein Activator 1), расположен в цитоплазме и является частью семейства GAP1-белков, активирующих GTPase. Продукт гена стимулирует активность GTPase нормального RAS p21, но не его онкогенного аналога. Действуя как супрессор функции RAS, этот белок усиливает слабую внутреннюю ГТФазную активность белков RAS, что приводит к образованию неактивной формы RAS, связанной с GDP. Это позволяет контролировать клеточную пролиферацию и дифференцировку.

Ген MAGEH1 принадлежит к подгруппе РT-генов суперсемейства меланомо-ассоциированного антигена (MAGE). Кодируемый белок связан с апоптозом, остановкой клеточного цикла, ингибированием роста или дифференцировкой клеток. Белок может быть вовлечен в передачу сигналов atRA через путь STAT1-альфа.

Ген NGFRAP1 контролирует апоптоз в неопластически трансформированных клетках после повреждения ДНК, что несущественно для развития, но влияет на клеточную адгезию и передачу сигналов фактора роста в трансформированных клетках. Ген NGFRAP1 участвует во внутриклеточной транспортировке ряда белков, также он необходим для стабильности и переноса в ядро AKT1/AKT, что способствует выживанию эндотелиальных клеток во время развития сосудов, служит зависимым от микротрубочек сигналом, который необходим для образования сократительного кольца миозина во время цитокинеза клеточного цикла.

Продукт гена BCL2 (B-cell lymphoma 2) является антиапоптозным белком, контролирующим проницаемость митохондриальной мембраны и ингибирующим каспазы вследствие предотвращения выхода цитохрома C из митохондрий и за счет связывания белка APAF1, активирующего апоптоз. Поэтому повышенная копийность данного гена может приводить к увеличению его транскрипционной активности и тем самым ингибировать апоптические процессы.

Гены CASP-3 и CASP-8 кодируют эффекторную каспазу 3 и инициаторную каспазу 8, критическую для запуска внешнего пути апоптоза. Запущенный каспазный каскад расщепляет другие клеточные мишени и приводит к реализации запрограммированной клеточной гибели [19].

Таким образом, с чувствительностью к терапии препаратами платины связаны генетические локусы, ответственные за репарацию ДНК, контроль пролиферации и апоптоза.

Следующим этапом работы явился анализ влияния изменения копийности этих генов на их транскрипционную активность.

Экспериментальный скрининг эпигенетических предикторов чувствительности опухолевых клеток языка к препаратам платины

Из образцов биопсии, полученных у больных плоскоклеточным раком языка до начала лечения, выделяли тотальную РНК, проводили обратную транскрипцию и оценивали уровень относительной экспрессии 18 генов (BRCA1, BLM, NBS1, ERCC1, ERCC2, EXO1, RAD50, PIF1, LIG1, BAX, BCL2, CASP3, CASP8, PML, RASA1, ERBB2, MAGEH1 и NGFRAP1), показавших дифференциальную копийность в двух группах пациентов, чувствительных и резистентных к терапии (рис. 6).

 

Рис. 6. Особенности относительной экспрессии генов у больных плоскоклеточным раком языка, чувствительных и резистентным к препаратам платины

Примечание. Статистически значимые отличия: * — от нормальной ткани (p < 0,01); ** — между двумя группами больных (p < 0,01).

 

Обнаружены статистически значимые (p < 0,01) отличия между образцами пациентов, чувствительных (группа 1) и резистентных (группа 2) к терапии, по экспрессии следующих генов: BRCA1 (в 4,7 раза выше в группе 2); BLM (в 8,0 раза выше в группе 2); ERCC1 (в 3,0 раза выше в группе 2); EXO1 (в 19,5 раз выше в группе 2); RAD50 (в 7,0 раза выше в группе 2); PIF1 (в 12,7 раза выше в группе 2); LIG1 (в 16,0 раза выше в группе 2); BCL2 (в 2,3 раза выше в группе 2); CASP8 (в 7,6 раза ниже в группе 2); ERBB2 (в 3,2 раза выше в группе 2); MAGEH1 (в 2,7 раза ниже в группе 2); NGFRAP1 (в 2,8 раза ниже в группе 2). В целом экспрессия данных генетических локусов положительно коррелировала с их копийностью (r — от 0,549 до 0,871). Таким образом, увеличение экспрессии генов BRCA1, BLM, ERCC1, EXO1, RAD50, PIF1, LIG1, BCL2, ERBB2 и снижение экспрессии генов MAGEH1, NGFRAP1 и CASP8 ассоциированы с резистентностью опухолевых клеток к препаратам платины.

Регуляция экспрессии генов — сложный биологический процесс, зависящий от числа копий гена, уровня метилирования и экспрессии некодирующих РНК [8]. Поэтому в нашем исследовании и наблюдается неполное соответствие изменения копийности генов и их экспрессии. Соответственно, отсутствие дифференциальной экспрессии генов NBS1, ERCC2, BAX, CASP3, PML и RASA1 между группами больных говорит об иных механизмах (помимо копийности), влияющих на их транскрипцию. Дифференциальная экспрессия генов BRCA1, BLM, ERCC1, EXO1, RAD50, PIF1, LIG1, BCL2, ERBB2, MAGEH1, NGFRAP1 и CASP8, коррелирующая с изменением числа их копий, между группами больных может служить функциональным подтверждением влияния показателя копийности этих генов на чувствительность опухолевых клеток к препаратам платины. А сами показатели копийности BRCA1, BLM, ERCC1, EXO1, RAD50, PIF1, LIG1, BCL2, ERBB2, MAGEH1, NGFRAP1 и CASP8 можно рассматривать как потенциальные маркеры чувствительности к терапии.

Показатель копийности генов во внеклеточной ДНК как предиктор чувствительности рака языка к препаратам платины

В настоящее время разработка высокоэффективных малоинвазивных подходов молекулярной диагностики и определение чувствительности к терапии невозможны без скрининга молекулярно-генетических маркеров во внДНК плазмы крови [20]. В качестве подобных маркеров особый интерес представляет показатель числа копий генов (Copy Number Variation, CNV) — особая форма полиморфизма, приводящая к изменению копийности генетического локуса и его экспрессии [19]. В плазме крови основными источниками внДНК являются ядерная и митохондриальная ДНК соматических или опухолевых клеток, подвергшихся процессам апоптоза и некроза, ДНК клеток крови и ДНК микроорганизмов [20]. Проведенный выше анализ позволил сформировать список генетических локусов, пoказатeль кoпийнoсти которых обладает значительным потенциалом для малоинвазивного определения чувствительности опухолей плоскоклеточного рака языка к терапии препаратами платины. На внДНК, выделенной из плазмы 50 пациентов с плоскоклеточным раком языка, чувствительных к терапии, и 50 пациентов с плоскоклеточным раком языка, резистентным к терапии, а также 30 условно здоровых доноров, проведена валидация потенциальных маркеров. В ходе валидации обнаружено статистически значимое (р < 0,005) отличие в копийности девяти генетических локусов между двумя группами пациентов (рис. 7).

 

Рис. 7. Особенности относительной копийности генов у больных плоскоклеточным раком языка, чувствительных и резистентным к препаратам платины, во внДНК плазмы крови

Примечание. Статистически значимые отличия: * — от условно здоровых доноров (p < 0,01); ** — между двумя группами больных (p < 0,01).

 

Так, обнаружена повышенная копийность генов BRCA1, BLM, EXO1, RAD50, PIF1 и LIG1 соответственно в 4,4 раза (р < 0,005), 3,9 (р < 0,05), 11,0 (р < 0,001), 6,0 (р < 0,01), 2,0 (р < 0,005) и 12,0 раза (р < 0,05) во внДНК у больных, резистентных к терапии препаратами платины, относительно больных, чувствительных к терапии. При этом обнаружена сниженная копийность генов CASP8, MAGEH1 и NGFRAP1 соответственно в 2,6 раза (р < 0,01), 2,0 (р < 0,05) и 1,8 раза (р < 0,05) во внДНК у больных, резистентных к терапии препаратами платины, относительно больных, чувствительных к терапии. Таким образом, в плазме крови больных плоскоклеточным раком языка обнаружен профиль копийности генов BRCA1, BLM, EXO1, RAD50, PIF1, LIG1, CASP8, MAGEH1 и NGFRAP1, дифференциальный для двух групп пациентов — чувствительных и резистентных к терапии препаратами платины.

Основываясь на этих данных, далее формирование диагностической панели генов маркеров чувствительности к терапии осуществляли на основе 66 пар генов. Попарное объединение 12 генов дает 66 их комбинаций:

C(n, r) = n! / (r! × (n – r)!), т.е.

${С}_{12}^2=\frac{12!}{2!(12-2)}=\frac{12!}{2!10!}=66.$

Для оценки диагностической значимости выбранных генов был проведен анализ их способности классифицировать пациентов на группу чувствительных или резистентных при помощи ROC-кривых. ROC-кривые со значением площади под кривой (AUC) не менее 0,70 представлены на рис. 8. Для пары генетических локусов BLM/NGFRAP1 значение AUC было 0,81; для BRCA1/MAGEH1 — 0,74; EXO1/RAD50 — 0,72 и PIF1/CASP8 — 0,70.

 

Рис. 8. ROC-кривые классификации групп больных плоскоклеточным раком языка, чувствительных (сплошная линия) и резистентных (прерывистая линия) к терапии, на основании показателя копийности генов. Представлены ROC-кривые со значением AUC ≥ 0,70

 

Из представленных на рис. 8 данных видно, что ни одна из пар маркеров не позволяет полностью разделить группы пациентов. Поэтому для получения надежной диагностической панели генов применили математический подход, основанный на LASSO-пенализованной логистической регрессии и оптимизированный при помощи bootstrap-наборов данных (рис. 9).

 

Рис. 9. LASSO-пенализованная модель для логистической регрессии уровня относительной копийности генетических локусов во внДНК плазмы крови: A — распределение регрессионных коэффициентов в bootstrap-наборах данных; Б — важность переменных в bootstrap-моделях; В — ROC-кривые для классификации образцов при помощи оптимизированной (сплошная линия) и неоптимизированной (прерывистая линия) моделей

 

На основании bootstrap-моделей получена финальная панель генов: BLM/NGFRAP1, BRCA1/MAGEH1, EXO1/ RAD50, BLM/CASP8, BRCA1/RAD50 и BRCA1/ EXO1. Такое сочетание генов обеспечивает диагностическую чувствительность на уровне 95%, а специфичность — на уровне 90% (AUC — 0,98) при разделении на группы пациентов, чувствительных и резистентных к терапии препаратами платины.

Заключение

Комплексный биоинформатический анализ данных секвенирования РНК (RNA-seq), данных о вариациях числа копий (CNV) и соответствующей клинико-патологической информации из базы данных TCGA и Gene Expression Omnibus (GEO) позволил выделить 65 генетических локусов, ассоциированных с чувствительностью к терапии препаратами платины. Лабораторный скрининг генетических и эпигенетических предикторов показал наличие дифференциальной экспрессии генов BRCA1, BLM, ERCC1, EXO1, RAD50, PIF1, LIG1, BCL2, ERBB2, MAGEH1, NGFRAP1 и CASP8, коррелирующей с изменением числа их копий, между группами больных, чувствительных и резистентных к терапии препаратами платины. Во внДНК у больных, резистентных к терапии препаратами платины, обнаружена повышенная копийность генов BRCA1, BLM, EXO1, RAD50, PIF1 и LIG1 и сниженная копийность генов CASP8, MAGEH1 и NGFRAP, что свидетельствует об ассоциации с чувствительностью злокачественных плоскоклеточных опухолей языка к терапии цисплатином генетических локусов, ответственных за репарацию ДНК (BRCA1, BLM, ERCC1, EXO1, RAD50, PIF1, LIG1), контроль пролиферации и апоптоза (BCL2, ERBB2, MAGEH1, NGFRAP1 и CASP8). На основании bootstrap-моделей получена панель генов — BLM/ NGFRAP1, BRCA1/MAGEH1, EXO1/RAD50, BLM/CASP8, BRCA1/RAD50 и BRCA1/EXO1, сочетание которых обеспечивает высокую диагностическую чувствительность и специфичность при разделении на группы пациентов, восприимчивых и резистентных к терапии препаратами платины.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. О.И. Кит — разработка дизайна исследования, научное редактирование текста статьи; М.А. Енгибарян — разработка дизайна исследования, анализ и интерпретация данных, научное редактирование текста статьи; А.К. Гварамия — сбор биологического материала, выполнение экспериментальной (клиническая) части работы, подготовка текста рукописи; В.Л. Волкова — сбор биологического материала, первичная обработка данных; Н.А. Чертова — первичная обработка биологического материала, выполнение экспериментальной (клинической) части работы; Д.С. Кутилин — разработка основной концепции исследования, проведение биоинформатического анализа, выполнение экспериментальной (молекулярной) части работы, написание текста рукописи. Все авторы статьи внесли существенный вклад в организацию и проведение исследования, прочли и одобрили окончательную версию рукописи перед публикацией.

 

Приложение. Данные из проектов TCGA-HNSC и GEO

№ п/п	Идентификатор	Пол	Возраст	Локализация опухоли	ВПЧ*
1	TCGA-CV-7406	Мужской	49	Основание языка	N
2	TCGA-CR-6472	Мужской	59	Основание языка	N
3	TCGA-DQ-7593	Мужской	58	Основание языка	N
4	TCGA-BA-6871	Мужской	75	Основание языка	N
5	TCGA-BB-4225	Мужской	73	Основание языка	N
6	TCGA-BB-4228	Мужской	50	Основание языка	N
7	TCGA-F7-A61V	Мужской	54	Основание языка	N
8	TCGA-BB-7861	Мужской	56	Основание языка	N
9	TCGA-CV-6950	Мужской	64	Основание языка	N
10	TCGA-CV-5439	Мужской	62	Основание языка	N
11	TCGA-DQ-7591	Мужской	62	Основание языка	N
12	TCGA-HD-8224	Мужской	63	Основание языка	N
13	TCGA-CN-A6V6	Мужской	59	Основание языка	N
14	TCGA-CN-A6UY	Мужской	57	Основание языка	N
15	TCGA-DQ-7594	Мужской	47	Основание языка	N
16	TCGA-CV-6943	Мужской	74	Основание языка	N
17	TCGA-T2-A6WZ	Мужской	53	Основание языка	N
18	TCGA-BB-7871	Женский	64	Основание языка	N
19	TCGA-CR-5250	Мужской	71	Основание языка	N
20	TCGA-CR-6477	Женский	56	Основание языка	N
21	TCGA-F7-A620	Мужской	47	Основание языка	N
22	TCGA-МЗ-А7D7	Мужской	51	Основание языка	N
23	TCGA-HD-8314	Мужской	58	Основание языка	N
24	TCGA-P3-A5QE	Мужской	49	Основание языка	N
25	OSCC_1 (GEO)	Мужской	50	Язык (не уточнен)	–
26	OSCC_2 (GEO)	Мужской	33	Язык (не уточнен)	+
27	OSCC_3 (GEO)	Мужской	45	Язык (не уточнен)	+
28	OSCC_4 (GEO)	Мужской	48	Язык (не уточнен)	–
29	OSCC_5 (GEO)	Мужской	22	Язык (не уточнен)	+
30	OSCC_6 (GEO)	Женский	48	Язык (не уточнен)	–
31	OSCC_7 (GEO)	Мужской	49	Язык (не уточнен)	–
32	OSCC_8 (GEO)	Женский	37	Язык (не уточнен)	+
33	OSCC_9 (GEO)	Женский	21	Язык (не уточнен)	+
34	OSCC_10 (GEO)	Мужской	46	Язык (не уточнен)	–
35	OSCC_11 (GEO)	Женский	50	Язык (не уточнен)	–
36	OSCC_12 (GEO)	Женский	34	Язык (не уточнен)	+
37	OSCC_13 (GEO)	Мужской	37	Язык (не уточнен)	–
38	OSCC_14(GEO)	Женский	36	Язык (не уточнен)	–
39	OSCC_15 (GEO)	Мужской	42	Язык (не уточнен)	–
40	TCGA-CQ-5329	Женский	46	Язык (не уточнен)	N
41	TCGA-CN-6998	Мужской	53	Язык (не уточнен)	N
42	TCGA-CR-7392	Женский	67	Язык (не уточнен)	N
43	TCGA-CQ-5333	Мужской	74	Язык (не уточнен)	N
44	TCGA-CV-7438	Женский	87	Язык (не уточнен)	N
45	TCGA-QK-AA3K	Мужской	60	Язык (не уточнен)	N
46	TCGA-CQ-6219	Женский	50	Язык (не уточнен)	N
47	TCGA-CR-7393	Мужской	26	Язык (не уточнен)	N
48	TCGA-HD-7831	Мужской	74	Язык (не уточнен)	N
49	TCGA-CN-4736	Женский	70	Язык (не уточнен)	N
50	TCGA-DQ-5631	Мужской	52	Язык (не уточнен)	N
51	TCGA-BA-A6DE	Женский	70	Язык (не уточнен)	N
52	TCGA-CV-5971	Мужской	60	Язык (не уточнен)	N
53	TCGA-CV-6945	Мужской	41	Язык (не уточнен)	N
54	TCGA-F7-A50J	Женский	67	Язык (не уточнен)	N
55	TCGA-UF-A7JS	Мужской	59	Язык (не уточнен)	N
56	TCGA-CV-A45P	Женский	82	Язык (не уточнен)	N
57	TCGA-CV-7103	Мужской	49	Язык (не уточнен)	N
58	TCGA-CV-5979	Мужской	26	Язык (не уточнен)	N
59	TCGA-CV-5970	Мужской	59	Язык (не уточнен)	N
60	TCGA-CN-4737	Мужской	19	Язык (не уточнен)	N
61	TCGA-BA-A6DB	Женский	24	Язык (не уточнен)	N
62	TCGA-CQ-7065	Мужской	40	Язык (не уточнен)	N
63	TCGA-HD-8634	Женский	51	Язык (не уточнен)	N
64	TCGA-CV-5976	Мужской	50	Язык (не уточнен)	N
65	TCGA-CN-6017	Мужской	55	Язык (не уточнен)	N
66	TCGA-CV-6933	Мужской	53	Язык (не уточнен)	N
67	TCGA-CX-7085	Женский	77	Язык (не уточнен)	N
68	TCGA-IQ-A61K	Женский	70	Язык (не уточнен)	N
69	TCGA-CN-6024	Мужской	66	Язык (не уточнен)	N
70	TCGA-BB-7863	Женский	43	Язык (не уточнен)	N
71	TCGA-CN-A498	Женский	61	Язык (не уточнен)	N
72	TCGA-MT-A51X	Мужской	30	Язык (не уточнен)	N
73	TCGA-CV-7236	Женский	77	Язык (не уточнен)	N
74	TCGA-CN-4725	Мужской	60	Язык (не уточнен)	N
75	TCGA-CV-6954	Мужской	59	Язык (не уточнен)	N
76	TCGA-CV-6961	Мужской	61	Язык (не уточнен)	N
77	TCGA-CQ-5325	Мужской	65	Язык (не уточнен)	N
78	TCGA-CV-6003	Женский	50	Язык (не уточнен)	N
79	TCGA-WA-A7H4	Мужской	69	Язык (не уточнен)	N
80	TCGA-D6-6825	Мужской	73	Язык (не уточнен)	N
81	TCGA-CN-4742	Женский	48	Язык (не уточнен)	N
82	TCGA-CR-7372	Мужской	45	Язык (не уточнен)	N
83	TCGA-CN-6996	Женский	58	Язык (не уточнен)	N
84	TCGA-QK-A652	Мужской	60	Язык (не уточнен)	N
85	TCGA-BA-4077	Женский	45	Язык (не уточнен)	N
86	TCGA-CV-6934	Женский	66	Язык (не уточнен)	N
87	TCGA-CV-5977	Мужской	66	Язык (не уточнен)	N
88	TCGA-CV-7255	Женский	32	Язык (не уточнен)	N
89	TCGA-DQ-5625	Женский	52	Язык (не уточнен)	N
90	TCGA-CN-5370	Мужской	78	Язык (не уточнен)	N
91	TCGA-D6-A4Z9	Мужской	59	Язык (не уточнен)	N
92	TCGA-IQ-A6SH	Мужской	55	Язык (не уточнен)	N
93	TCGA-BB-4224	Мужской	52	Язык (не уточнен)	N
94	TCGA-CV-6441	Мужской	60	Язык (не уточнен)	N
95	TCGA-CQ-5327	Женский	61	Язык (не уточнен)	N
96	TCGA-CN-5367	Женский	60	Язык (не уточнен)	N
97	TCGA-CQ-6218	Женский	52	Язык (не уточнен)	N
98	TCGA-C9-A47Z	Женский	72	Язык (не уточнен)	N
99	TCGA-CR-7390	Мужской	67	Язык (не уточнен)	N
100	TCGA-CV-A6JT	Мужской	65	Язык (не уточнен)	N
101	TCGA-CV-A465	Мужской	24	Язык (не уточнен)	N
102	TCGA-BA-4075	Мужской	49	Язык (не уточнен)	N
103	TCGA-4P-AA8J	Мужской	66	Язык (не уточнен)	N
104	TCGA-CV-7238	Женский	69	Язык (не уточнен)	N
105	TCGA-F7-A61S	Мужской	62	Язык (не уточнен)	N
106	TCGA-CV-6952	Женский	65	Язык (не уточнен)	N
107	TCGA-P3-A5QA	Мужской	41	Язык (не уточнен)	N
108	TCGA-IQ-A61L	Женский	72	Язык (не уточнен)	N
109	TCGA-CR-7391	Женский	36	Язык (не уточнен)	N
110	TCGA-CV-A45T	Женский	64	Язык (не уточнен)	N
111	TCGA-CQ-6221	Мужской	79	Язык (не уточнен)	N
112	TCGA-D6-8569	Мужской	52	Язык (не уточнен)	N
113	TCGA-CV-6436	Мужской	62	Язык (не уточнен)	N
114	TCGA-F7-A50G	Мужской	66	Язык (не уточнен)	N
115	TCGA-CV-A6JO	Мужской	69	Язык (не уточнен)	N
116	TCGA-CV-6956	Мужской	67	Язык (не уточнен)	N
117	TCGA-D6-6515	Женский	82	Язык (не уточнен)	N
118	TCGA-F7-A61W	Мужской	51	Язык (не уточнен)	N
119	TCGA-CV-5973	Женский	62	Язык (не уточнен)	N
120	TCGA-IQ-A61H	Мужской	76	Язык (не уточнен)	N
121	TCGA-CV-6951	Мужской	57	Язык (не уточнен)	N
122	TCGA-CV-A45R	Мужской	46	Язык (не уточнен)	N
123	TCGA-DQ-5630	Мужской	73	Язык (не уточнен)	N
124	TCGA-HD-A6HZ	Женский	79	Язык (не уточнен)	N
125	TCGA-KU-A6H8	Мужской	41	Язык (не уточнен)	N
126	TCGA-CQ-5330	Женский	69	Язык (не уточнен)	N
127	TCGA-CQ-6229	Мужской	61	Язык (не уточнен)	N
128	TCGA-CN-A642	Мужской	57	Язык (не уточнен)	N
129	TCGA-CR-7397	Мужской	44	Язык (не уточнен)	N
130	TCGA-BA-4074	Мужской	69	Язык (не уточнен)	N
131	TCGA-CV-7104	Женский	61	Язык (не уточнен)	N
132	TCGA-CQ-A4CH	Мужской	58	Язык (не уточнен)	N
133	TCGA-CV-A6JU	Женский	61	Язык (не уточнен)	N
134	TCGA-CR-6493	Мужской	69	Язык (не уточнен)	N
135	TCGA-DQ-5624	Женский	43	Язык (не уточнен)	N
136	TCGA-BA-A6DG	Мужской	49	Язык (не уточнен)	N
137	TCGA-HD-8635	Женский	61	Язык (не уточнен)	N
138	TCGA-BA-6873	Мужской	28	Язык (не уточнен)	N
139	TCGA-IQ-A6SG	Женский	61	Язык (не уточнен)	N
140	TCGA-CV-7446	Мужской	66	Язык (не уточнен)	N
141	TCGA-BB-A6UO	Женский	61	Язык (не уточнен)	N
142	TCGA-CR-7394	Мужской	70	Язык (не уточнен)	N
143	TCGA-CV-7180	Мужской	34	Язык (не уточнен)	N
144	TCGA-IQ-A61E	Женский	55	Язык (не уточнен)	N
145	TCGA-CV-A6K0	Мужской	58	Язык (не уточнен)	N
146	TCGA-CV-6433	Мужской	57	Язык (не уточнен)	N
147	TCGA-CQ-7072	Мужской	51	Язык (не уточнен)	N
148	TCGA-IQ-A61J	Мужской	54	Язык (не уточнен)	N
149	TCGA-DQ-7592	Мужской	57	Язык (не уточнен)	N
150	TCGA-CQ-6224	Мужской	52	Язык (не уточнен)	N
151	TCGA-CN-4733	Мужской	61	Язык (не уточнен)	N
152	TCGA-CQ-A4CA	Мужской	‘--	Язык (не уточнен)	N
153	TCGA-D6-A4ZB	Мужской	61	Язык (не уточнен)	N
154	TCGA-CQ-A4CE	Женский	76	Язык (не уточнен)	N
155	TCGA-CQ-6222	Мужской	63	Язык (не уточнен)	N
156	TCGA-CR-7401	Мужской	64	Язык (не уточнен)	N
157	TCGA-CV-6939	Мужской	60	Язык (не уточнен)	N
158	TCGA-C9-A480	Женский	45	Язык (не уточнен)	N
159	TCGA-CV-6941	Мужской	51	Язык (не уточнен)	N
160	TCGA-BA-7269	Мужской	61	Язык (не уточнен)	N
161	TCGA-H7-A6C4	Женский	35	Язык (не уточнен)	N
162	TCGA-CN-A640	Женский	40	Язык (не уточнен)	N
163	TCGA-MT-A67A	Женский	85	Язык (не уточнен)	N
164	TCGA-CN-6019	Мужской	61	Язык (не уточнен)	N
165	TCGA-CV-6959	Мужской	48	Язык (не уточнен)	N
166	TCGA-CR-7382	Мужской	49	Язык (не уточнен)	N
167	TCGA-CR-6488	Женский	68	Язык (не уточнен)	N
168	TCGA-UP-A6WW	Мужской	58	Язык (не уточнен)	N
169	TCGA-CV-7243	Мужской	50	Язык (не уточнен)	N
170	TCGA-D6-6823	Мужской	50	Язык (не уточнен)	N
171	TCGA-CN-6016	Мужской	64	Язык (не уточнен)	N

Примечание. N — нет информации; «–» — ВПЧ отсутствует.

About the authors

Oleg I. Kit

National Medical Research Center for Oncology

Author for correspondence.
Email: rnioi@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-3061-6108
SPIN-code: 1728-0329

MD, PhD, Professor, Corresponding Member of the RAS

Russian Federation, 63 bldg 12 Line 14, 344037, Rostov-on-Don

Marina A. Engibaryan

National Medical Research Center for Oncology

Email: rnioi@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-7293-2358
SPIN-code: 1764-0276

MD, PhD

Russian Federation, 63 bldg 12 Line 14, 344037, Rostov-on-Don

Astanda K. Gvaramiya

National Medical Research Center for Oncology

Email: rnioi@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-3546-6014
SPIN-code: 2700-3410

MD

Russian Federation, 63 bldg 12 Line 14, 344037, Rostov-on-Don

Victoria L. Volkova

National Medical Research Center for Oncology

Email: rnioi@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-8291-0750
SPIN-code: 8289-6300

MD, PhD

Russian Federation, 63 bldg 12 Line 14, 344037, Rostov-on-Don

Natalia A. Chertova

National Medical Research Center for Oncology

Email: rnioi@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9279-9408
SPIN-code: 7051-4574

MD, PhD

Russian Federation, 63 bldg 12 Line 14, 344037, Rostov-on-Don

Denis S. Kutilin

National Medical Research Center for Oncology

Email: k.denees@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8942-3733
SPIN-code: 8382-4460

PhD (Biology), Leading Researcher

Russian Federation, 63 bldg 12 Line 14, 344037, Rostov-on-Don

References

Supplementary files