The Role of Angiogenesis Mediators in the Mobilization of Early and Late Endothelial Progenitor Cells from the Bone Marrow in Coronary Heart Disease

Full Text

Обоснование

Сердечно-сосудистые заболевания продолжают оставаться ведущей причиной смерти населения в большинстве экономически развитых и развивающихся стран мира. Ишемическая кардиомиопатия (ИКМП) представляет собой тяжелую форму ишемической болезни сердца (ИБС), не имеющей на сегодняшний день специфической фармакотерапии и характеризующейся прогрессированием болезни у части больных даже после хирургической коррекции коронарного русла и полости левого желудочка [1, 2]. Это демонстрирует недостаточную изученность патогенеза ИКМП, в котором на сегодняшний день активно обсуждается роль хронического воспаления, апоптоза кардиомиоцитов, нарушений гомеостаза кальция и сократительной функции миокарда, синтеза различных типов коллагенов и дисфункции микрососудов [2–4]. Интерес ученых сосредоточен на вазомоторной форме эндотелиальной дисфункции [5, 6], однако ее ангиогенная форма, включающая нарушение ангиогенеза, баланса репаративных и деструктивных процессов в сосудах [7], остается без должного внимания.

Индукция ангиогенеза при ИБС необходима для формирования коллатерального кровотока и репарации поврежденных атеросклерозом сосудов, что имеет защитно-приспособительное значение при ИБС и ИКМП. Известно, что реализуют ангиогенез эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК), экспрессирующие рецептор к фактору роста сосудистого эндотелия 2-го типа (VEGFR2). Для части этих клеток характерно гемопоэтическое происхождение (СD34⁺) — это ранние и поздние ЭПК, имеющие соответственно моноцитарный и немоноцитарный иммунофенотип (соответственно СD14⁺ и СD14^–), а часть ЭПК имеет внекостномозговую природу, происходя из мезенхимальных стволовых клеток, локализованных в сосудистой стенке коронарного синуса и дуги аорты. ЭПК могут как непосредственно дифференцироваться в эндотелиоциты, так и паракринным образом стимулировать ангиогенез и выживаемость эндотелиоцитов [8]. Медиаторами ангиогенеза, активирующими пролиферацию, дифференцировку, мобилизацию и хоуминг ЭПК, являются: фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), гипоксия-индуцируемый фактор (HIF), фактор стромальных клеток (SDF-1), колониестимулирующие факторы гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и гранулоцитов (G-CSF) [8, 9], а также, возможно, моноцитарный хемотаксический фактор (MCP-1), который как главный хемоаттрактант моноцитов может способствовать миграции ЭПК моноцитарного иммунофенотипа из костного мозга в кровь [10, 11].

Понимание особенностей регуляции ангиогенеза при ИКМП, в отличие от ИБС без кардиомиопатии, поможет установить патогенез данного заболевания и найти мишени для патогенетически обоснованной терапии ИКМП, которая замедлит ее прогрессирование.

Цель исследования — установить особенности изменения баланса ранних и поздних эндотелиальных прогениторных клеток и субпопуляций VEGFR2⁺ клеток в крови и костном мозге во взаимосвязи с содержанием медиаторов ангиогенеза и численностью десквамированных эндотелиальных клеток в крови у больных ИБС, страдающих и не страдающих ИКМП.

Методы

Дизайн исследования

Проведено одномоментное, клиническое, контролируемое (случай–контроль) исследование с марта 2019 по июнь 2022 г. с участием 52 больных ИБС, находившихся в кардиохирургическом стационаре: 30 человек, страдающих ИКМП, и 22 человека, не страдающих ИКМП, а также 15 здоровых доноров. У больных ИБС периферическую кровь забирали в день операции до ее проведения, костный мозг — интраоперационно.

Критерии соответствия

Проведено одномоментное, клиническое, контролируемое (случай–контроль) исследование, в которое вошло 52 больных ИБС (86,5% мужчины) со стенокардией напряжения II–IV функционального класса и недостаточностью кровообращения II–III функционального класса по NYHA в возрасте от 48 до 69 лет (табл. 1), находившихся в кардиохирургическом стационаре на этапе обследования перед проведением операции коронарного шунтирования. Все пациенты имели в анамнезе острый инфаркт миокарда и были распределены на две группы: 1) больные ИКМП — 30 человек (27 мужчин и 3 женщины), у которых регистрировались критерии ИКМП (фракция выброса левого желудочка ≤ 40%, реваскуляризация в анамнезе или показание к таковой, ≥ 75% стеноз ствола левой коронарной артерии или проксимальной части передней нисходящей артерии или ≥ 75% стеноз двух или более эпикардиальных сосудов [12]); 2) больные ИБС без кардиомиопатии — 22 человека (18 мужчин и 4 женщины), у которых также имелись реваскуляризация в анамнезе или показание к таковой и стеноз коронарных сосудов любой локализации ≥ 75%, но фракция выброса левого желудочка была > 40%.

Группу контроля составили 15 человек (12 мужчин и 3 женщины), сопоставимых по возрасту с больными в группах исследования, находившихся, по данным профилактического осмотра, в состоянии относительного здоровья, не страдающих сердечно-сосудистой патологией и не предъявляющих жалоб соответствующего или иного характера.

Критериями исключения обследуемых лиц из исследования считали наличие аутоиммунных и опухолевых заболеваний, аллергического процесса в стадии обострения, анемии, хронических инфекций (вирусных гепатитов, сифилиса, ВИЧ-инфекции), проведение курсов иммуномодулирующей терапии или наличие острых инфекционных заболеваний менее чем за 3 нед до исследования, а также отказ пациента от исследования. Все пациенты и здоровые доноры подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Условия проведения

Исследование выполнено на базе отделения сердечно-сосудистой хирургии Научно-исследовательского института кардиологии — филиала ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск) и кафедры патофизиологии ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Томск). В исследование были включены больные европеоидного происхождения из Сибирского и Дальневосточного федеральных округов (39 и 5 соответственно). Формирование группы здоровых доноров производилось на базе ОГАУЗ «Поликлиника № 3» г. Томска из лиц, проживающих в г. Томске.

Продолжительность исследования

Исследование планировалось провести с марта 2019 по май 2021 г., но ввиду пандемии COVID-19 и редкой встречаемости ИКМП проект был продлен еще на 1 год (до июня 2022 г.), в течение которого обследовались преимущественно больные ИКМП.

Описание медицинского вмешательства

Периферическую кровь у больных ИБС обеих групп исследования забирали из кубитальной вены перед операцией коронарного шунтирования, красный костный мозг — интраоперационно, из разреза грудины после выполнения доступа к сердцу путем срединной стернотомии и до подключения аппарата искусственного кровообращения. У здоровых доноров забор периферической крови производили из кубитальной вены утром натощак. Кровь (5 мл) и костный мозг (2 мл) стабилизировали гепарином в дозе 25 Ед/мл.

Больным ИБС проводилось общепринятое и сходное в группах лечение лекарственными средствами: антиангинальная терапия с применением нитратов продленного действия, бета1-адреноблокаторов, коррекция липидного обмена с использованием статинов и коррекция гемостаза путем назначения антиагрегантов и анткоагулянтов. Доля лиц, принимавших данные препараты, была сопоставимой в группах, за исключением частоты использования блокаторов Сa²⁺-каналов, которые у пациентов с ИКМП не назначались, в отличие от больных ИБС без кардиомиопатии (соответственно 0 и 63,6%; р < 0,001), ввиду их негативного влияния на сократимость миокарда, которая при ИКМП снижена вследствие его сократительной дисфункции.

Исходы исследования

Основной исход исследования. Путем сопоставления содержания ранних VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ и поздних VEGFR2⁺CD34⁺CD14^– ЭПК в крови и костном мозге между группами больных ИБС, а также с показателями в крови у здоровых доноров оценивали миграцию этих клеток из костного мозга в кровь. Если отличия по этим параметрам отмечаются между группами больных только в крови при соизмеримых значениях в костном мозге, то нарушена мобилизация ЭПК при сопоставимой генерации клеток в миелоидной ткани; если отличия по параметрам ЭПК обнаруживаются и в крови, и в костном мозге, то нарушена их генерация в миелоидной ткани.

Роль цитокинов в детерминации численности ЭПК в крови изучали путем сравнения концентрации фактора стромальных клеток 1 (SDF-1), фактора роста сосудистого эндотелия А (VEGF-А), моноцитарного хемотаксического протеина 1 (МСР-1), колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и гранулоцитов (G-CSF) в плазме крови больных ИБС обеих групп и у здоровых доноров.

Дополнительные исходы исследования. Оценивали общее содержание VEGFR2⁺ клеток, VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺ и VEGFR2⁺CD34^–CD14^– клеток в образцах периферической крови и костного мозга у больных ИБС обеих групп и в крови у здоровых доноров как параметров, демонстрирующих распределение клеток с проангиогенным потенциалом (экспрессируют VEGFR2). Также в крови у больных ИБС обеих групп и здоровых доноров регистрировали содержание десквамированных эндотелиальных клеток с иммунофенотипом CD45^–CD146⁺ с целью оценки степени деструкции сосудистого эндотелия и интерпретации причин и последствий изменения численности ЭПК в крови.

Методы регистрации исходов

Содержание VEGFR2⁺ клеток и их иммунофенотипов VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ (ранние ЭПК), VEGFR2⁺CD34⁺CD14^– (поздние ЭПК), VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺ и VEGFR2⁺CD34^–CD14^– клетки определяли в цельной гепаринизированной (25 Ед/мл) крови методом проточной цитофлуориметрии с использованием проточного цитометра Accuri С6 (BDBiosciens, США) и с помощью моноклональных антител VEGFR2(KDR; CD309)-Alexa Fluor 647, CD34-PE и CD14-FITC (BD Biosciens, США), а также лизирующего раствора (BD Biosciens, США) согласно инструкциям производителя. Анализ полученных данных осуществляли при помощи программного приложения BD Cell Quest for Mac OS® X (BD Biosciens, США). Содержание VEGFR2⁺ клеток идентифицировали на скаттерограммах в области мононуклеаров (ранние и поздние ЭПК выделяют из мононуклеаров крови [8]) как долю (%) от общего числа мононуклеаров. Далее идентифицированные VEGFR2⁺ клетки распределяли по экспрессии CD34 и CD14 на иммунофенотипы: VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ (ранние ЭПК), VEGFR2⁺CD34⁺CD14^– (поздние ЭПК), VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺ и VEGFR2⁺CD34^–CD14^– клетки, содержание которых выражали в процентах от численности мононуклеаров, при этом сумма процентного содержания четырех иммунофенотипов в совокупности равнялась доле VEGFR2⁺ клеток в крови (рис. 1).

 

Рис. 1. Алгоритм гейтирования иммунофенотипов VEGFR2+ клеток, включая ранние и поздние эндотелиальные прогениторные клетки: А — распределение лейкоцитов крови по фронтальному и боковому светорассеянию; Б — гейтирование мононуклеаров по VEGFR2 и СD14 для оценки экспрессии VEGFR2+ клеток; В — гейтирование VEGFR2+ клеток по СD34+ и СD14+ для оценки иммунофенотипов VEGFR2+ клеток, включая ранние (VEGFR2+ СD34+СD14+) и поздние (VEGFR2+ СD34+СD14–) эндотелиальные прогениторные клетки

 

Содержание десквамированных эндотелиальных клеток определяли в цельной гепаринизированной (25 Ед/ мл) крови как долю CD45^–CD146⁺ клеток среди всех анализируемых клеток крови и соотносили с общим количеством лейкоцитов, экспрессирующих CD45+ (CD45 — общий лейкоцитарный антиген), выражая десквамированные эндотелиальные клетки в ×10⁵/л. Общее количество лейкоцитов в крови оценивали методом проточной цитометрии с помощью гематологического анализатора XS-1000i (Sysmix Corporation, Япония).

Плазму крови получали путем центрифугирования гепаринизированной (25 Ед/мл) цельной крови при 300 g в течение 10 мин и хранили при температуре –80 °С для последующей оценки концентрации фактора стромальных клеток 1 (SDF-1), фактора роста сосудистого эндотелия А (VEGF-А), моноцитарного хемотаксического протеина 1 (МСР-1), колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и гранулоцитов (G-CSF) методом мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа с помощью коммерческой тест-системы для мультиплексного анализа Magnetic Luminex Assay Kit for SDF1, SCF, VEGFA, VEGFВ, GM-CSF, G-CSF, FGF1, МСР1 (Cloud-Clone-Corp., США) и автоматизированного анализатора Bio-Plex Protein Assay System (Bio-Rad, США).

Этическая экспертиза

Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическим комитетом Сибирского государственного медицинского университета (№ 6175 от 6 ноября 2018 г.). Всеми пациентами и донорами было подписано информированное согласие об участии в исследовании.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica for Windows 10.0. Для статистического описания результатов исследования вычисляли медиану, 25-й и 75-й процентили. С целью проверки нулевой гипотезы при сравнении зависимых выборок использовали критерий Вилкоксона, при сравнении независимых выборок — критерий Манна–Уитни, применяя поправку Бенджамини–Хохберга для множественного сравнения. Для оценки взаимо-связей между изучаемыми показателями рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Результаты статистического анализа считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты

Объекты (участники) исследования

В течение трех лет больные ИБС, поступающие в кардиохирургический стационар с целью проведения операции коронарного шунтирования и удовлетворяющие критериям включения и исключения, распределялись согласно верифицированному диагнозу на две группы — пациенты с ИКМП и пациенты без ИКМП, средний возраст которых был сопоставимым между группами (см. табл. 1). Возраст здоровых лиц составил 59,0 [50, 0; 65, 5] года и не отличался от групп больных (соответственно р = 0,572 и р = 0,318). Больные ИБС обеих групп также были сопоставимыми по полу, индексу массы тела, доле курящих лиц, функциональному классу стенокардии и недостаточности кровообращения. Однако для пациентов с ИКМП (относительно больных ИБС без кардиомио- патии) было характерным большее значение конечного систолического индекса и меньшее значение фракции выброса левого желудочка (см. табл. 1), поскольку снижение последней менее 40% было критерием диагностики ИКМП и распределения больных на группы. Более частая встречаемость сахарного диабета 2 типа отмечалась у больных ИБС без кардиомиопатии, а хронических нарушений мозгового кровообращения — у пациентов с ИКМП (см. табл. 1). Доля больных, имевших заболевания легких (пневмофиброз, хроническая обструктивная болезнь легких), была сопоставимой между группами пациентов.

 

Таблица 1. Клиническая характеристика больных с ишемической болезнью сердца, страдающих и не страдающих ишемической кардиомиопатией

Показатель	Больные ИБС		p-value
	без ИКМП	с ИКМП
Количество больных, n В том числе: • мужчины, n (%) • женщины, n (%)	22 18 (81,81) 4 (18,18)	30 27 (90,00) 3 (10,00)	— 0,658 0,658
Возраст, лет	64,0 [59, 5; 67, 0]	61,0 [56, 0; 64, 0]	0,110
Курение, n (%)	15 (68,18)	12 (40,0)	0,084
Индекс массы тела, кг/м2	29,65 [26, 25; 32, 75]	28,00 [26, 75; 31, 25]	0,530
Функциональный класс стенокардии, n (%): • II • III • IV	4 (18,18) 16 (72,73) 2 (9,09)	7 (23,33) 20 (66,67) 3 (10,00)	0,916 0,870 0,714
Функциональный класс недостаточности кровообращения (по NYHA), n (%): • I • II • III	2 (9,09) 9 (40,91) 11 (50,00)	2 (6,67) 19 (63,33) 9 (30,00)	0,840 0,187 0,240
Фракция выброса ЛЖ, %	59,50 [50, 25; 67, 00]	30,00 [22, 00; 36, 00]	< 0,001
Конечный систолический индекс ЛЖ, мл/м2	52,90 [50, 20; 56, 90]	75,30 [64, 30;82, 30]	0,004
Масса миокарда ЛЖ, г	187,5 [142, 8; 215, 0]	233,5 [222, 3; 265, 3]	0,001
Гипертоническая болезнь, n (%): • I • II • III	0 3 (13,6) 18 (81,81)	1 (3,3) 5 (16,7) 21 (70,0)	0,875 0,929 0,517
Дислипидемия, n (%)	20 (90,9)	23 (76,7)	0,332
Концентрация холестерола в крови (достигнута медикаментозно), ммоль/л	3,29 [3, 00; 3, 70]	4,00 [3, 60; 4, 80]	0,140
ХНМК, n (%)	13 (59,1)	27 (90,0)	0,023
Сахарный диабет 2 типа, n (%)	7 (31,82)	2 (6,67)	0,046
Легочные заболевания, n (%)	3 (13,67)	5 (16,67)	0,929

Примечание. ИБС — ишемическая болезнь сердца; ИКМП — ишемическая кардиомиопатия; ЛЖ — левый желудочек; ХНМК — хронические нарушения мозгового кровообращения; р — уровень статистической значимости различий между группами больных.

 

Основные результаты исследования

Анализ полученных данных показал, что содержание ранних VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ ЭПК в крови у больных ИБС без кардиомиопатии было повышенным в 3,9 раза относительно показателя здоровых доноров и в 2,4 раза — относительно значений пациентов с ИКМП, у которых численность этих клеток соответствовала норме (табл. 2). Между тем численность поздних VEGFR2⁺CD34⁺CD14^– ЭПК в крови проявляла лишь аналогичные тенденции и варьировала у пациентов обеих групп в пределах физиологических значений (см. табл. 2). Следует отметить, что результаты сравнительного анализа численности поздних ЭПК в крови у больных ИБС без кардиомиопатии до использования поправки на множественное сравнение Бенджамина–Хохберга выявили почти 2-кратное превышение их числа над параметрами здоровых доноров (р = 0,042), однако применение указанной поправки трансформировало статистически значимый результат в незначимый при p < 0,05 (р = 0,083; см. табл. 2). В костном мозге содержание ранних и поздних ЭПК не различалось между группами больных ИБС (см. табл. 2). При этом сравнение численности этих клеток в миелоидной ткани относительно крови выявило превышение миелоидных показателей над гемическими у больных обеих групп исследования, но только для поздних ЭПК. Содержание ранних ЭПК в крови и костном мозге было сопоставимым. Между тем обращала на себя внимание тенденция к превышению уровня ранних ЭПК в крови над их значением в костном мозге у больных ИБС без кардиомиопатии, а у пациентов с ИКМП — напротив, превышение миелоидных значений содержания ранних ЭПК над гемическими (см. табл. 1).

 

Таблица 2. Содержание VEGFR2⁺ клеток и их субпопуляций, включая ранние и поздние эндотелиальные прогениторные клетки, в крови и костном мозге у больных ишемической болезнью сердца, страдающих и не страдающих ишемической кардиомиопатией, Me [Q₁–Q₃]

Относительное содержание VEGFR2+ клеток и их субпопуляций	Группа обследуемых лиц
	ИБС без ИКМП	ИБС с ИКМП	Здоровые доноры
Кровь
VEGFR2+ клетки, %	10,00 [8, 20; 11, 60] рк = 0,005	7,55 [3, 50; 11, 00] рк = 0,460 р2 = 0,274	5,40 [4, 30; 6, 50]
Ранние ЭПК VEGFR2+CD34+CD14+, %	0,74 [0, 46; 1, 23] рк < 0,001	0,31 [0, 15; 0, 64] рк = 0,260 р2 = 0,038	0,19 [0, 13; 0, 32]
Поздние ЭПК VEGFR2+CD34+CD14–, %	0,21 [0, 11; 0, 55] рк = 0,083	0,09 [0, 04; 0, 18] рк = 0,926 р2 = 0,096	0,11 [0, 06; 0, 16]
Клетки VEGFR2+CD34–CD14+, %	1,84 [1, 14; 3, 12] рк = 0,252	1,70 [0, 71; 2, 60] рк = 0,807 р2 = 0,974	1,41 [0, 89; 1, 83]
Клетки VEGFR2+CD34–CD14–, %	7,08 [4, 05; 9, 07] рк = 0,166	6,33 [2, 32; 9, 17] рк = 0,463 р2 = 0,792	4,10 [3, 26; 4, 70]
Костный мозг
VEGFR2+ клетки, %	7,50 [5, 10; 14, 40] р1 = 0,153	6,85 [4, 10; 8, 30] р1 = 0,833 р2 = 0,325	—
Ранние ЭПК VEGFR2+CD34+CD14+, %	0,58 [0, 48; 1, 36] р1 = 0,530	0,57 [0, 45; 0, 98] р1 = 0,234 р2 = 0,546	—
Поздние ЭПК VEGFR2+CD34+CD14–, %	0,33 [0, 10; 0, 90] р1 = 0,047	0,41 [0, 10; 0, 46] р1 = 0,049 р2 = 0,644	—
Клетки VEGFR2+CD34–CD14+, %	1,05 [0, 33; 2, 00] р1 = 0,272	0,87 [0, 76; 1, 09] р1 = 0,374 р2 = 0,915	—
Клетки VEGFR2+CD34–CD14–, %	5,98 [2, 28; 11, 39] р1 = 0,790	5,24 [2, 60; 6, 24] р1 = 0,953 р2 = 0,649	—

Примечание. ИБС — ишемическая болезнь сердца; ИКМП — ишемическая кардиомиопатия; р_к — уровень статистической значимости различий показателей по сравнению со здоровыми донорами; р₁ — по сравнению с кровью у соответствующей группы больных; р₂ — по сравнению с больными ИБС без кардиомиопатии.

 

Концентрация SDF-1, МСР-1 и GM-CSF в крови у больных ИБС без кардиомиопатии была повышенной относительно группы здоровых доноров, чего у пациентов с ИКМП не отмечалось (табл. 3). Концентрация VEGFA и G-CSF в крови у пациентов с ИБС вне зависимости от наличия ИКМП соответствовала таковой у здоровых доноров (см. табл. 3). Статистически значимых различий в концентрации изучаемых медиаторов при их сравнении между группами больных ИБС не отмечалось (см. табл. 3).

 

Таблица 3. Концентрация медиаторов ангиогенеза и десквамированных эндотелиальных клеток в крови у больных ишемической болезнью сердца, страдающих и не страдающих ишемической кардиомиопатией, Me [Q₁–Q₃]

Концентрация цитокинов в крови	Группа обследуемых лиц
	ИБС без ИКМП	ИБС с ИКМП	Здоровые доноры
SDF-1, пг/мл	60,00 [50, 00; 81, 00] рк = 0,041	49,00 [37, 00; 56, 00] рк = 0,174 р2 = 0,760	30,00 [5, 00; 45, 00]
VEGF-A, пг/мл	3,00 [2, 00; 4, 50] рк = 0,688	3,00 [2, 00; 4, 67] рк = 0,930 р2 = 0,869	2,59 [0, 49; 4, 83]
MCP-1, пг/мл	223,0 [180, 0; 297, 0] рк = 0,046	202,5 [170, 5; 249, 75] рк = 0,098 р2 = 1,000	175,1 [140, 0; 204, 0]
GM-CSF, пг/мл	2,10 [1, 45; 3, 40] рк = 0,038	1,48 [1, 16; 2, 00] рк = 0,138 р2 = 0,236	0,96 [0, 46; 1, 41]
G-CSF, пг/мл	1,74 [1, 40; 3, 80] рк = 0,465	1,69 [1, 00; 2, 20] рк = 0,469 р2 = 0,528	1,00 [0, 32; 3, 51]
ДЭК, ×105/л	7,25 [6, 80; 7, 47] рк = 0,039	7,26 [5, 43; 17, 94] рк = 0,038 р2 = 0,260	5,12 [3, 73; 5, 84]

Примечание. ИБС — ишемическая болезнь сердца; ИКМП — ишемическая кардиомиопатия; ДЭК — десквамированные эндотелиальные клетки.

 

Дополнительные результаты исследования

Показано, что содержание VEGFR2⁺ в крови было повышенным у больных ИБС без кардиомиопатии, а у пациентов с ИКМП соответствовало показателям у здоровых доноров (см. табл. 2). При этом отличий по данному параметру в костном мозге между группами пациентов не отмечалось. Численность VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺ и VEGFR2⁺CD34^–CD14^– клеток в крови и костном мозге у больных ИБС, страдающих и не страдающих ИКМП, не отличалась ни между группами пациентов, ни между типами биоматериала, ни по сравнению со здоровыми донорами. При этом иммунофенотип VEGFR2⁺CD34^–CD14^– был самым многочисленным из четырех субпопуляций VEGFR2⁺ клеток как в крови, так и в костном мозге (см. табл. 2). Содержание CD45^–CD146⁺ десквамированных эндотелиальных клеток в крови у больных ИБС превышало их количество у здоровых доноров вне зависимости от наличия ИКМП (см. табл. 2).

Анализ взаимосвязей между содержанием различных цитокинов в крови у больных ИБС объединенной выборки (пациенты, страдающие и не страдающие ИКМП в совокупности) показал положительную корреляцию плазменной концентрации SDF-1 и G-CSF (r = 0,74; p < 0,05) и содержания обоих медиаторов с уровнем GM-CSF (соответственно r = 0,55; p < 0,01, и r = 0,46; p < 0,05) и VEGF-А (соответственно r = 0,80; p < 0,001, и r = 0,84; p < 0,001). Наряду с этим в крови содержание VEGF-А было позитивно взаимосвязанным с концентрацией МСР-1 (r = 0,39; p < 0,05). Примечательно, что корреляционных связей между концентрацией цитокинов и численностью VEGFR2⁺ клеток и их субпопуляциями в крови выявлено не было. При этом содержание VEGFR2⁺ клеток в крови оказалось положительно взаимосвязанным с количеством ранних VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ ЭПК (r = 0,54; p < 0,01), долей VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺ и VEGFR2⁺CD34^–CD14^– клеток (соответственно r = 0,77; p < 0,01, и r = 0,93; p < 0,001), но не с уровнем поздних VEGFR2⁺CD34⁺CD14^– ЭПК.

Нежелательные явления

В ходе обследования у одного больного из группы ИБС без кардиомиопатии было зарегистрировано незначительное пролонгированное кровотечение из области венопункции.

Обсуждение

Согласно полученным данным, у больных ИБС без кардиомиопатии в крови было повышенным содержание ранних VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ ЭПК при аналогичной тенденции со стороны количества поздних VEGFR2⁺CD34⁺CD14^– ЭПК, чего у пациентов с ИКМП не отмечалось (см. табл. 2). Данный факт свидетельствует об усиленном привлечении ЭПК с репаративным потенциалом из костного мозга в кровь при ИБС без кардиомиопатии, что является компенсаторной реакцией при атерогенезе и, очевидно, обеспечивает репаративный ангиогенез и формирование коллатералей. Ранние ЭПК способны паракринным образом стимулировать выживаемость зрелых эндотелиоцитов и дифференцировку их предшественников, секретируя проангиогенные факторы (VEGF, ангиопоэтин и др.), а также in vitro дифференцироваться в эндотелиоциты при культивировании в «эндотелиальных условиях» (гипоксия, VEGF и др.). Поздние ЭПК могут не только дифференцироваться в эндотелиоциты, но и формировать тубулярные структуры, участвуя в васкулогенезе [8, 9]. У пациентов с ИКМП компенсаторная активация мобилизации ЭПК, по всей видимости, не реализуется: содержание и ранних, и поздних ЭПК в крови сохранялось на физиологическом уровне (см. табл. 2). При этом отсутствие накопления ЭПК в крови при ИКМП нельзя объяснить их усиленной миграцией в ткани и эффективным участием в ангиогенезе, поскольку степень деструкции эндотелия (по содержанию десквамированных эндотелиальных клеток) была повышенной и сопоставимой с таковой у больных ИБС без кардиомиопатии (см. табл. 3), а не меньшей, как следовало бы ожидать при активации хоуминга ЭПК. Очевидно, физиологический уровень ЭПК в крови при ИКМП недостаточен для репарации коронарных сосудов в условиях атеросклероза, что, вероятно, способствует более выраженной, чем при ИБС без кардиомиопатии, ишемии миокарда и развитию его сократительной дисфункции. При этом ранние ЭПК играют ведущую роль в ангиогенезе при ИБС (p < 0,05), участие поздних ЭПК менее значимо и может быть принято за истину при только при уровне статистической значимости р < 0,10 (см. табл. 2).

Содержание клеток с иммунофенотипами VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺ и VEGFR2⁺CD34^–CD14^– в крови у больных ИБС вне зависимости от наличия ИКМП проявляло тенденцию к увеличению, но не достигало достоверных различий с нормой (см. табл. 2). Клетки с фенотипом VEGFR2⁺CD34^–CD14^– нельзя считать тождественными негемопоэтическим прогениторным эндотелиальным клеткам, которые происходят из стволовых клеток в сосудистой стенке корня аорты [13], поскольку VEGFR2-рецептор экспрессируется и на зрелых эндотелиоцитах, и на некоторых лейкоцитах, включая нейтрофилы [14] и лимфоциты [15]. Несмотря на то что стратегия гейтирования исключала область гранулоцитов, некоторые клетки все же могли попасть в анализ. Кроме того, активированные лимфоциты (и CD4⁺, и CD8⁺, и Foxp3⁺) способны экспрессировать VEGFR2, особенно в составе инфильтрата при опухолевом процессе [15]. В связи с этим популяция VEGFR2⁺CD34^–CD14^– самая многочисленная, вероятно, потому, что включает в себя несколько видов клеток. Учитывая факт экспрессии VEGFR2-рецептора на лейкоцитах, обнаружение клеток с иммунофенотипом VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺ у больных ИБС и здоровых доноров, очевидно, связано с экспрессией на моноцитах VEGFR2-рецептора, благодаря чему они тоже способны участвовать в ангиогенезе, однако направленность этого процесса не уточняется. В частности, V. Genkel et al. (2022) установили, что при развитии даже субклинического атеросклероза уменьшается содержание VEGFR2⁺ нейтрофилов в крови, которые, как предполагают авторы, мигрируют в бляшку и, стимулируя в ней ангиогенез, оказывают проатерогенное действие [14]. В этой связи VEGFR2⁺ моноциты (VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺) могут оказывать как аналогичное проатерогенное действие, так и репаративное влияние на эндотелий, что предстоит еще выяснить. Тем не менее по данным настоящего исследования значимая роль этой популяции клеток в патогенезе ИБС в целом и ИКМП в частности отсутствует (см. табл. 2). Накопление в крови у больных ИБС без кардиомиопатии VEGFR2⁺ клеток, по всей видимости, обусловлено суммацией позитивных тенденций каждого иммунофенотипа и коррелирует с количеством клеток трех иммунофенотипов VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺, VEGFR2⁺CD34^–CD14⁺ и VEGFR2⁺CD34^–CD14^– (см. выше), кроме VEGFR2⁺CD34⁺CD14^– как самого малочисленного (см. табл. 2).

Сравнительный анализ общего содержания VEGFR2⁺ клеток и их иммунофенотипов в костном мозге у больных ИБС отличий между группами пациентов не выявил (см. табл. 2). В совокупности с аккумуляцией ранних ЭПК в крови у больных ИБС без кардиомиопатии это свидетельствует о том, что у данных пациентов усилена мобилизации ранних ЭПК из костного мозга в кровь, а не их генерация в миелоидной ткани. Следовательно, при ИКМП усиленное привлечение ранних ЭПК в кровь не отмечается по причине нарушения их мобилизации, но образование этих клеток в костном мозге при ИКМП не нарушено. Важно отметить, что сопоставление численности изучаемых клеток в крови и костном мозге у больных ИБС установило превышение миелоидного показателя над гемическим только для содержания поздних ЭПК, что соответствует данным об их генерации в костном мозге [8].

Центральным регулятором ангиогенеза является HIF-1, поскольку усиливает транскрипцию генов нескольких проангиогенных белков (SDF-1, VEGF, PDGFB, ангиопоэтина-1 и -2) и их рецепторов [16], благодаря чему препятствует ишемическому повреждению миокарда [17]. Согласно ранее опубликованным данным, у больных ИКМП (в отличие от больных ИБС без кардио-миопатии) обнаруживается дефицит HIF-1α в крови [18, 19]. Это, вероятно, определяет отсутствие компенсаторной гиперпродукции SDF-1 при гипоксии, а также влияет на секрецию МСР-1 и GM-CSF. Концентрация SDF-1, МСР-1 и GM-CSF в крови у больных ИБС без кардиомио- патии была повышенной относительно группы здоровых доноров, у пациентов с ИКМП этого не отмечалось (см. табл. 3). Известно, что накопление SDF-1 в плазме стимулирует мобилизацию CXCR4⁺ клеток из костного мозга, включая гемопоэтические стволовые клетки и ЭПК, которые экспрессируют CXCR4 как рецептор к SDF-1. Взаимодействие SDF-1 и CXCR4 также активирует привлечение и удержание стволовых клеток в ишемизированных областях [9, 20, 21]. Другой хемоаттрактант МСР-1, активируя после взаимодействия с CCR2 пути p42/44ERK1/2, p38 MAPK и JNK1 [22], не только приводит к миграции из костного мозга в кровь моноцитов [23], но и дозозависимо стимулирует мобилизацию ЭПК [10]. Кроме того, МСР-1 обеспечивает прикрепление моноцитарных ЭПК к поврежденному эндотелию, что сопровождается дифференцировкой их в клетки, экспрессирующие эндотелиальные маркеры (Tie2, CD31, VE-кадгерин), и ингибированием гиперплазии интимы сосудов [10, 23]. Между тем GМ-CSF оказывает на ЭПК прямой пролиферативный эффект, опосредованный сигнальными путями PI3R/Akt, JNK, ERK и приводящий к активации циклина D1 и E [24]. Также GМ-CSF, являясь многолинейным гемопоэтином, стимулирует пролиферацию и дифференцировку миелоидных клеток-предшественниц, участвуя и в моноцитопоэзе [25]. При этом МСР-1 и GМ-CSF являются медиаторами воспаления [22, 25], и их физиологический уровень в крови согласуется с другими признаками иммуносупрессии при ИКМП (избыток интерлейкина-10 и недостаток М-CSF в крови [19]), которая, вероятно, замедляет развитие сахарного диабета при ИКМП и объясняет его более редкую встречаемость, чем у больных ИБС без кардиомиопатии (см. выше). Интегрируя данные литературы с результатами настоящего исследования, можно заключить, что при ИКМП отсутствие накопления ЭПК в крови связано, по всей вероятности, с недостаточным ответом клеток на гипоксию (SDF-1 и HIF-1α) и слабой выраженностью воспалительной реакции (по МСР-1 и GМ-CSF) при наличии атеросклеротического процесса. Анергия медиаторного ответа при ИКМП, очевидно, затрудняет мобилизацию ЭПК в кровь под действием хемоаттрактантов SDF-1 и МСР-1 и, возможно, ограничивает их пролиферативную активность с участием GМ-CSF.

Несмотря на сопоставимость концентрации VEGF-A и G-CSF в крови между группами больных ИБС и ее соответствие их физиологическому уровню (см. табл. 3), по-видимому, эти цитокины тоже вовлечены в регуляцию ангиогенеза, что подтверждается наличием трех положительных корреляций их плазменного уровня с большинством изучаемых индукторов ангиогенеза (см. выше). Показано, что G-CSF-индуцированная мобилизация ЭПК связана с увеличением в циркуляции числа нейтрофилов, высвобождающих VEGF, и стимуляцией мобилизации гемопоэтических стволовых клеток посредством костномозговых нейтрофилов, секретирующих эластазу и катепсин G [9]. Синтез VEGF-A может быть индуцирован МСР-1 [11], что согласуется с обнаруженной в настоящем исследовании положительной связью этих показателей (см. выше). В свою очередь, VEGF-A взаимодействует с VEGFR1 и VEGFR2, стимулируя пролиферацию и дифференциацию ЭПК в эндотелиальные клетки, образование тубулярных структур и повышение проницаемости сосудистой стенки [26, 27]. Учитывая, что при гипоксии возрастает экспрессия VEGFR1 [26], который является рецептором-ловушкой для VEGF-A и способен ингибировать ангиогенез [27], VEGF-A у пациентов с ИКМП может или не синтезироваться в избытке ввиду неадекватной реакции организма на гипоксию (дефицит HIF-1α [18]), или синтезируемый VEGF-A может оказаться связанным с VEGFR1. Между тем ожидаемая корреляция между содержанием цитокинов и ранних/поздних ЭПК в крови не была зарегистрирована, очевидно, по причине многообразия потенцирующих друг друга эффектов изучаемых медиаторов ангиогенеза. Это могло привести к нелинейным зависимостям между их концентрацией и численностью ЭПК в крови, притом что коэффициент корреляции выявляет лишь линейную взаимосвязь.

Ограничения исследования

Результаты проведенного исследования могут быть ограничены клиническим статусом больных, поскольку полученные данные справедливы для больных ИБС с гемодинамически значимым многососудистым поражением магистральных коронарных артерий, которое требует проведения коронарного шунтирования, и перенесших инфаркт миокарда. Ввиду этого у пациентов в начальной стадии ИБС с только формирующейся ИКМП установленные в настоящем исследовании отличия могут еще не обнаруживаться, что требует дальнейших исследований. Не исключено, что ограничения могут касаться региона проживания и национальной принадлежности больных ИБС, так как результаты получены для лиц европеоидного происхождения, проживающих преимущественно в Сибирском федеральном округе. Следует отметить ограниченный объем выборки больных ИБС. Последующее накопление данных, возможно, позволит получить достоверные различия для содержания поздних ЭПК в крови у больных ИБС без кардиомиопатии по сравнению со здоровыми донорами.

Заключение

Таким образом, развитие ИБС без кардиомиопатии характеризуется компенсаторным (в ответ на атеросклеротическое повреждение сосудов и повышенную десквамацию эндотелия) усилением мобилизации ранних VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ ЭПК из костного мозга в кровь в условиях избытка SDF-1 и МСР-1 в кровотоке и, возможно, усилением пролиферативного потенциала этих клеток вследствие профицита GM-CSF в крови. Формирование ИКМП ассоциировано с анергией проангиогенного медиаторного ответа, проявляющейся физиологическим уровнем SDF-1, МСР-1 и GM-CSF в крови, что препятствует усиленной мобилизации ранних VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ ЭПК в кровоток при наличии повышенной десквамации эндотелия, однако их генерация в костном мозге при ИКМП не нарушена. Субпопуляционный состав и общая численность VEGFR2⁺ клеток в костном мозге при ИКМП соответствуют таковым при ИБС без кардиомиопатии. При этом реактивность пула ранних VEGFR2⁺CD34⁺CD14⁺ ЭПК при ИБС без кардиомиопатии значимо выше, чем поздних VEGFR2⁺CD34⁺CD14^– ЭПК, численность которых при ИБС соответствует норме вне зависимости от наличия ИКМП. Непосредственная роль VEGF-А и G-CSF в дисрегуляции ангиогенеза при ИКМП не подтверждается ввиду их физиологических значений у больных ИБС, как страдающих, так и не страдающих ИКМП, но данные цитокины взаимосвязаны с концентрацией SDF-1 и МСР-1 и GM-CSF в крови. Полученные результаты в дальнейшем позволят разработать патогенетически обоснованную цитокиновую и/или клеточную терапию данного заболевания путем стимуляции ангиогенеза, замедлив прогрессирование ИКМП и повысив качество жизни больных.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-20038 (https://rscf.ru/project/22-25-20038/) и средств Администрации Томской области.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. С.П. Чумакова — разработка дизайна исследования, статистическая обработка результатов исследования, их интерпретация, анализ литературы, написание текста рукописи; О.И. Уразова — материально-техническое обеспечение проведения лабораторных исследований, интерпретация результатов, утверждение текста рукописи; В.М.Шипулин — консультирование членов научной группы по вопросам планирования дизайна исследования и интерпретации результатов; О.А. Денисенко — выполнение проточной цитофлуориметрии, анализ результатов; М.В. Гладковская — пробоподготовка биоматериала, выполнение иммуноферментного анализа; С.Л. Андреев — взаимодействие с пациентами, обеспечение клинического материала, интерпретация результатов; К.В. Невская — выполнение проточной цитофлуориметрии, анализ результатов; Ю.В. Колобовникова — материально-техническое обеспечение проведения лабораторных исследований, интерпретация результатов. Все авторы согласны нести ответственность за все аспекты работы, чтобы обеспечить надлежащее рассмотрение и решение всех возможных вопросов, связанных с корректностью и надежностью любой части работы.

About the authors

Svetlana P. Chumakova

Siberian State Medical University

Author for correspondence.
Email: Chumakova_S@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3468-6154

MD, PhD, Associate Professor, Pathophysiology Division 

Россия, Tomsk

Olga I. Urazova

Siberian State Medical University

Email: urazova72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9457-8879

MD, PhD, Professor, Corresponding Member of the RAS, Pathophysiology Division 

Россия, Tomsk

Vladimir M. Shipulin

Siberian State Medical University; Cardiology Research Institute of the Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Email: shipulin@cardio-tomsk.ru
ORCID iD: 0000-0003-1956-0692

MD, PhD, Professor, Pathophysiology Division

Россия, Tomsk; Tomsk

Olga A. Denisenko

Siberian State Medical University

Email: olga-muraveinik@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4524-8491

Applicant, Pathophysiology Division

Россия, Tomsk

Margarita V. Gladkovskaya

Siberian State Medical University

Email: gladkovskay0@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1163-3439

PhD Student, Pathophysiology Division 

Россия, Tomsk

Sergey L. Andreev

Cardiology Research Institute of the Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Email: anselen@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-4049-8715

MD, PhD

Россия, Tomsk

Ksenia V. Nevskaya

Siberian State Medical University

Email: nevskayaksenia@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1659-8812

MD, PhD, Central Research Laboratory 

Россия, Tomsk

Yulia V. Kolobovnikova

Siberian State Medical University

Email: kolobovnikova.julia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7156-2471

MD, PhD, Associate Professor, Pathophysiology Division, Normal Physiology Division 

Россия, Tomsk

References

Supplementary files