Тканеинженерные конструкции для нужд сердечно-сосудистой хирургии: возможности персонификации и перспективы использования

Полный текст

На сегодняшний день отмечается непрерывный рост частоты развития атеросклероза населения, в том числе с поражением коронарных артерий и периферических кровеносных сосудов [1]. В связи с этим возрастает количество хирургических вмешательств по восстановлению эффективного кровотока в поврежденных кровеносных сосудах посредством их протезирования или наложения шунтов [2]. Наилучшим вариантом для проведения шунтирующих операций является использование аутологичных кровеносных сосудов, которые, однако, имеют ограниченную доступность по причине ранее перенесенных операций с использованием данных сосудов, прогрессирующего атеросклероза и других заболеваний. В свою очередь, при наличии огромного диапазона синтетических сосудистых протезов, присутствующих на рынке и в значительной степени закрывающих потребности кардиохирургии, нейрохирургии и микрохирургии, они не способны удовлетворить растущую потребность в использовании протезов сосудов диаметром менее 4 мм вследствие развития тромбозов, гиперплазии неоинтимы и кальцификации [3, 4].

Одна из перспективных современных областей, занимающихся разработкой эффективных протезов кровеносных сосудов, — сосудистая тканевая инженерия [5, 6]. Существуют различные подходы тканевой инженерии кровеносных сосудов, но все они направлены на создание функционально активного сосудистого имплантата, имеющего строение, схожее с организацией тканей нативной артерии, и демонстрирующего проходимость в отдаленный послеоперационный период [7–9].

Первый подход — выращивание собственного нового сосуда непосредственно в организме на месте функционально активного каркаса, способного задавать привлекаемым клеткам вектор развития в сторону формирования новообразованной сосудистой ткани и обладающего возможностью адаптивного роста. Основой подобного протеза выступает искусственный трубчатый матрикс, чаще всего выполненный из биодеградируемых природных или синтетических полимеров, обладающих высокой биосовместимостью и длительным сроком резорбции. Заселение матрикса клетками in situ, т.е. непосредственно в месте имплантации, происходит благодаря естественным процессам биоремоделирования имплантата, в том числе за счет высокой пористости стенки протеза, что способствует полноценной миграции клеток из кровотока и окружающих тканей с последующей их пролиферацией и дифференцировкой в сосудистом направлении [10, 11].

Введение биологически активных веществ в состав тканеинженерного сосудистого протеза, таких как ростовые факторы, хемокины, интерлейкины, аминокислоты и пр., и их пролонгированное высвобождение могут имитировать естественные биохимические сигналы и направлять процесс регенерации с формированием всех структурных слоев сосудистой ткани, в том числе эндотелия [12, 13]. Быстрая эндотелизация, формирование слоя гладкомышечных клеток и большое количество клеток, продуцирующих межклеточный матрикс, являются решающими факторами, обеспечивающими высокий уровень проходимости тканеинженерных сосудистых протезов за счет эффективного ремоделирования сосудистой ткани без фиброза и дегенерации.

Однако подходы формирования высокопористых трубчатых каркасов сосудистых протезов сопряжены с рядом рисков несостоятельности конечного изделия: тромбозом и преждевременной резорбцией трубчатого каркаса протеза с формированием аневризм [10, 14–17].

Идею формирования собственного нового сосуда на месте резорбируемого высокопористого сосудистого протеза невозможно реализовать, если не выполнить несколько важных шагов в процессе проектирования: 1) сделать внутреннюю поверхность тканеинженерного сосудистого протеза менее пористой, но сохраняющей свою структурную привлекательность для сиддинга эндотелиальных клеток и не провоцирующей адгезию тромбоцитов; 2) дополнительно усилить атромбогенные свойства сосудистых протезов посредством модификации их поверхности высокоэффективными лекарственными препаратами, влияющими на разные звенья гемостаза; 3) сформировать антианевризматическую защиту резорбируемого каркаса.

Таким образом, тканеинженерный сосудистый протез должен оставаться удобной площадкой для миграции и прикрепления сосудистых клеток с целью формирования новообразованной сосудистой ткани, а ремоделированная стенка протеза не должна подвергаться аневризматическому расширению даже в случае неконтролируемо быстрой резорбции полимерного каркаса протеза.

В Научно-исследовательском институте комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний г. Кемерово был разработан и протестирован в условиях in vitro и в экспериментах in vivo на мелких и крупных лабораторных животных сосудистый протез малого диаметра, изготовленный из биодеградируемых полимеров полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) и содержащий в своем составе проангиогенные факторы (GF mix): сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-А), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и хемоаттрактантную молекулу SDGF-1α. Содружественное использование данных биологически активных компонентов, послойно инкорпорированных в стенку сосудистого протеза в процессе эмульсионного электроспиннинга, призвано не только обеспечить единый проангиогенный эффект, но и усилить эффект каждой отдельно взятой биологически активной молекулы. Схема действия VEGF-A, bFGF SDF-1α, включенных в состав сосудистого протеза PHVV/PCL, представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Предполагаемая схема механизмов, обусловливающих клеточный отклик и привлечение клеток в стенку биодеградируемого сосудистого протеза PHBV/PCL/GF mix

 

На эндотелии сосудов располагаются два рецептора — VEGFR-1 и VEGFR-2 [18, 19]. Наиболее функционально значимые сигналы VEGF-A в организме опосредуются через VEGFR-2. Предполагается, что VEGF-A, высвобождаясь из стенки сосудистого протеза и попадая в кровоток, связывается с рецепторами VEGFR-1 и VEGFR-2, расположенными на цитоплазматической мембране эндотелиальных клеток и их предшественников. VEGFRs — тирозинкиназные рецепторы, имеющие внеклеточный домен для связывания с лигандом, а также трансмембранный и цитоплазматический, включая участок тирозинкиназы. Связывание данных лигандов с рецептором VEGFR-2 ведет к его димерезации и аутофосфорилированию по остаткам тирозина. Фосфорилированные остатки тирозина являются мишенями для адапторных белков, содержащих киназу или фосфотирозин-связывающий домен. В результате запускаются различные внутриклеточные сигнальные пути, приводящие к активации соответствующих генов с последующим синтезом матричной РНК, которая запускает каскад синтеза различных белков и ферментов, индуцирующих миграцию, пролиферацию и выживание клетки, выработку оксида азота, сосудистую проницаемость. Антиапоптотическое действие VEGF-A обеспечивает выживание эндотелиальных клеток. VEGF-A стимулирует миграцию клеток через синтез NO, который регулирует формирование фокальной адгезии и фосфорилирование FAK в эндотелиальных клетках. Свободный внутриклеточный Ca²⁺ связывается с кальмодулином, образуя комплекс, который активирует eNOS, что приводит к увеличению синтеза оксида азота. Все перечисленные процессы в итоге обеспечивают устойчивую миграцию эндотелиальных клеток к VEGF- A, инкорпорированному в состав сосудистых протезов, с последующим их прикреплением к полимерным нитям и синтезу собственных белков внеклеточного матрикса, например коллагена IV типа.

Одна из важных функций основного фактора роста фибробластов — стимуляция роста эндотелиальных клеток и организация их в трубчатую структуру [20]. При выделении bFGF из стенки сосудистого протеза в кровоток может происходить его связывание с рецепторами FGFR1 эндотелиальных клеток-предшественников гемопоэтического происхождения (рис. 1). На фоне активации тирокиназной активности идет запуск внутриклеточной передачи сигнала, появляются транскрипционные факторы и начинается экспрессия соответствующих генов. Происходят активация NADH-оксидаз и каспаз, а также опосредованная активация рецепторов VEGFR1 и включение с-Akt-модулин/калмодулин-зависимого сигнала. На этом фоне активируются митозы эндотелиальных клеток, повышается их выживаемость, миграция и пролиферация. После миграции эндотелиальных клеток к поверхности сосудистого протеза с комплексом GF mix фактор bFGF, продолжающий выделяться из структуры протеза, поддерживает выживаемость привлеченных клеток. Помимо этого, присутствие bFGF в составе биодеградируемого сосудистого протеза способно стимулировать миграцию гладкомышечных клеток из зон анастомоза в стенку протеза, а также дифференцировку фибробластов в миофибробласты.

Хемокину SDF-1α приписывается роль хемоаттрактанта в процессе ангиогенеза для эндотелиальных предшественников, а также для хоуминга гемопоэтических клеток в естественную нишу [21]. Основываясь на уже известных рецептор-зависимых механизмах клеточного переноса под воздействием SDF-1α, можно предположить, что выделяющийся из стенки сосудистого протеза SDF-1α захватывается рецепторами CXCR4, которые присутствуют на прогениторных клетках гемопоэтического происхождения (см. рис. 1). Активированный CXCR4 увеличивает внутриклеточную мобилизацию кальция и вызывает фосфорилирование компонентов фокальной адгезии. Далее с участием вторичных мессенджеров, так называемых Gi-белков, происходит трансмембранный перенос SDF-1α в клетку с последующей активацией соответствующих генов. Активируется секреция различных матричных металлопротеиназ, включая MMP-2 и MMP- 9, участвующих в миграции клеток. Также стимулируется секреция VEGF и экспрессия CD44 — рецептора гиалуроновой кислоты, с последующей активацией интегринов VLA-4 и LFA-1, молекул адгезии VCAM и VE-кадгерина, что в совокупности готовит клетку к устойчивой адгезии. Подготовленная к миграции и адгезии клетка продолжает мигрировать к локальному градиенту SDF-1α, находящемуся в структуре сосудистого протеза (см. рис. 1). Через схожие механизмы SDF-1α способен стимулировать миграцию гладкомышечных клеток из окружающих тканей.

Проходимость сосудистых протезов PHBV/PCL/GF mix диаметром 1,5 мм спустя 12 мес после имплантации в аорту крыс составила 93,3% [12]. Заселение клетками пористой стенки биодеградируемого протеза после его имплантации в сосудистое русло происходило благодаря естественным процессам ремоделирования имплантата с формированием трехслойной новообразованной сосудистой ткани, схожей со строением стенки нативного сосуда (рис. 2). В том числе было доказано образование устойчивого эндотелиального монослоя, что является критичным моментом для обеспечения долгосрочной эффективности протезов после их имплантации в сосудистое русло (см. рис. 2).

 

Рис. 2. Сравнительная оценка проходимости и ремоделирования сосудистых протезов PHBV/PCL/GF mix диаметром 1,5 мм через 12 мес имплантации в брюшную часть аорты крыс (в сравнении с немодифицированными аналогами) [12]

 

Для проведения преклинических испытаний на модели крупных лабораторных животных выбраны овцы. Овечья модель считается оптимальной для оценки роста, проходимости, эндотелизации, тромборезистентности и постимплантационной визуализации тканеинженерных сосудистых протезов малого диаметра [22, 23]. Овцы быстро достигают своих максимальных размеров и далее не растут, что важно для долговременной имплантации сосудистых протезов. Овцы пригодны для «моделирования наихудшего случая» вследствие повышенной склонности их сосудов к кальцификации, что позволяет провести максимально строгое тестирование сосудистых протезов на предмет их дегенерации in vivo [24].

С учетом результатов собственных пилотных исследований на модели овцы [25], а также неудачных результатов зарубежных коллег по имплантации биодеградируемых сосудистых протезов в сонную артерию овец [10, 26] протокол изготовления протезов PHBV/PCL/GF mix до проведения основного этапа преклинических испытаний на овцах был существенно усовершенствован. Технология изготовления биодеградируемого сосудистого протеза включила в себя формирование антианевризматического внешнего каркаса из поликапролактона и поверхностного лекарственного покрытия на основе илопроста (Ilo) и нефракционированного гепарина (Hep) [27, 28], что позволило в течение 20 сут гарантировать стабильный выход лекарственных препаратов в терапевтической дозе на внутреннюю поверхность протеза и тем самым обезопасить протезы от раннего тромбоза и дать в дальнейшем возможность сосудистым клеткам мигрировать к поверхности и в толщу стенки протеза с переходом в полноценное ремоделирование (рис. 3).

 

Рис. 3. Биодеградируемый сосудистый протез PHBV/PCL/GF mix^Hep/Ilo с антианевризматическим каркасом

 

Оправданность использования дополнительной атромбогенной защиты поверхности сосудистого протеза обусловлена в том числе особенностями гемостазио-логического профиля овец, который характеризовался повышенной скоростью тромбообразования вследствие массивного ответа на индукцию АДФ, большей прочностью образовавшегося сгустка и меньшей способностью к лизису по сравнению с пациентами с ишемической болезнью сердца [29]. Поэтому даже само оперативное вмешательство на сонных артериях без имплантации сосудистых протезов приводило к снижению доли проходимости оперированных сосудов на 12,5% [25].

В итоге спустя 12 мес имплантации в сонную артерию овец биодеградируемых сосудистых протезов PHBV/PCL/GF mix^Hep/Ilo с комплексом ростовых факторов и лекарственным покрытием получена их 50%-я проходимость, а ремоделированная стенка протеза практически повторяла строение стенки интактной контрлатеральной сонной артерии овцы (рис. 4) [30].

 

Рис. 4. Сравнительная гистологическая картина стенки ремоделированного сосудистого протеза PHBV/PCL/GF mix^Hep/Ilo диаметром 4 мм спустя 12 мес после имплантации и интактной сонной артерии овцы [30]

 

Сформированная неоиентима по строению полностью повторяла внутреннюю выстилку сонной артерии овцы. При гистологическом исследовании эксплантированных образцов протезов отмечено, что на их основе действительно сформировались основные элементы новообразованной сосудистой ткани, свойственные сонной артерии: неоинтима, покрытая слоем эндотелиальных клеток; медия, состоящая из гладкомышечноподобных клеток; адвентиция, содержавшая все элементы, свойственные данному слою, — коллагеновые волокна, лимфоидные фолликулы и vasa vasorum (см. рис. 4). Однако в стенке ремоделированных протезов отсутствовали эластические волокна, что дополнительно аргументирует правильность выбора в пользу создания антианевризматической защиты биодеградируемых сосудистых протезов.

Переход к регенеративной и персонализированной медицине обусловливает необходимость поиска решений, обеспечивающих создание индивидуальных медицинских изделий не только с учетом анатомии пациента, но и с использованием аутологичного биологического материала. Поэтому в рамках второго популярного подхода сосудистой тканевой инженерии по созданию клеточнозаселенных сосудистых протезов в условиях in vitro в НИИ КПССЗ была разработана технология изготовления биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра в условиях прекондиционирования напряжением сдвига. При этом биологической составляющей протеза стали эндотелиальные клетки и белки, полученные из периферической крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Известно, что основной проблемой во всем мире является невозможность получение от пациента аутологичных прогениторных эндотелиальных клеток в количестве, достаточном для создания индивидуальных клеточнозаселенных конструкций [31]. Общепринятые способы стимуляции костномозгового кроветворения или перепрограммирования в эндотелиальные других клеточных линий трудоемки, малоэффективны и, самое главное, небезопасны.

Эндотелиальные колониеформирующие клетки (КФЭК) — перспективные кандидаты для использования в регенеративной медицине. Однако существует проблема их крайне низкого содержания в периферической крови. На основании теории сосудистого происхождения КФЭК мы предположили, что механическое воздействие при проведении внутрисосудистых вмешательств (чрес-кожного коронарного вмешательства (ЧКВ) и коронарного шунтирования (КШ)) может вызвать повышение циркулирующих предшественников КФЭК в периферической крови и, соответственно, индуцировать рост данных клеток в культуре.

Выявлено, что механическое воздействие во время процедуры ЧКВ значительно повышало иммобилизацию в кровь предшественников КФЭК с высоким и средним пролиферативным потенциалом и увеличивало вероятность их выделения в культуре (рис. 5) [31]. При этом для последующих этапов работ по получению мононуклеарной фракции и ее дальнейшему культивированию достаточно всего 20 мл периферической крови, забранной от пациента во время процедуры ЧКВ.

 

Рис. 5. Относительное количество положительных результатов культивирования в точках забора крови у пациентов, перенесших операцию коронарного шунтирования (КШ) и чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ), %

Примечание. * — р < 0,05 по сравнению с результатами до вмешательства [31].

 

Последующее культивирование in vitro мононуклеарной фракции крови по усовершенствованным протоколам Колбе привело к усиленному росту колоний и получению в большом количестве колониеформирующих эндотелиальных клеток негемопоэтического происхождения, обладающих морфологией и фенотипом зрелых эндотелиальных клеток, что было доказано методами проточной цитофлуориметрии и иммунофлуоресцентного исследования (рис. 6, 7).

 

Рис. 6. Примеры гистограмм различных антигенов на популяциях CD45– и HUVEC (проточная цитофлуориметрия) [31]

 

Рис. 7. Фотографии колоний CD45– и HUVEC, выполненные на конфокальном микроскопе [31]

 

В случае положительных результатов культивирования наблюдали прогрессивное увеличение относительного содержания популяции CD45– от 1,8 до 87,6% (см. рис. 6). Популяция CD45– во всех образцах и временных диапазонах культивирования сохраняла стабильный фенотип и была однородной по составу. Клетки CD45– обладали выраженной экспрессией эндотелиального поверхностного антигена CD146 и CD31, умеренной CD309, в 89,9–95,5% содержали фактор фон Виллебранда (vWF), на их мембране полностью отсутствовал CD133. При этом небольшая часть клеток (0,1–9,1%) была позитивна по CD34 (см. рис. 6). Популяция CD45– не экспрессировала маркеров гемопоэтических иммунных клеток CD3, CD14, HLADR (см. рис. 6). В качестве сравнения представлен фенотип эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), который совпадал с фенотипом культуры, полученной из мононуклеарной фракции крови пациентов [31].

На мембране HUVEC и популяции CD45– ярко детектировались рецепторы CD31 и умеренно — CD309 (см. рис. 7), межклеточные контакты хорошо видны по присутствию белка клеточной адгезии CD144, характерного для эндотелия сосудов (см. рис. 7).

Внутри HUVEC и культуры CD45– определяли тельца Вейбеля–Паладе, а также диффузные и сетчатые скопления vWF, что подтвердило способность клеток синтезировать фактор фон Виллебранда (см. рис. 7).

Таким образом, колонии клеток CD45–, полученных из крови пациентов с ишемической болезнью сердца, являлись колониеформирующими эндотелиальными клетками, поскольку обладали характерной морфологией и фенотипом зрелых эндотелиальных клеток (CD146+CD31+CD144+CD309+vWF+CD34+/–CD133–) [31]. И то количество КФЭК, которое возможно получить из периферической крови пациентов с ишемической болезнью сердца, достаточно не только для создания персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза, но и для формирования криобанка аутологичных эндотелиальных клеток.

Персонификацию полимерного трубчатого каркаса будущего клеточнозаселенного сосудистого протеза можно также достичь с помощью создания аутологичного белкового покрытия, привлекательного для адгезии клеток. Покрытие из фибрина имеет ряд преимуществ перед другими биополимерами. Способность фибрина поддерживать адгезию и миграцию, служить биологической клеточной нишей, контролировать ангиогенез, накапливать и дозированно высвобождать факторы роста является уникальной и крайне полезной для тканевой сосудистой инженерии [32]. Огромный потенциал формования позволяет получать сложные трехмерные формы, использовать фибрин в качестве как самостоятельного каркаса, так и модифицирующего покрытия или пропитки [33, 34]. При этом фибрин также можно получить из периферической крови пациентов.

Было доказано, что в сравнении с другими белками (коллагеном, фибронектином), рутинно используемыми при проведении культуральных работ в качестве фидерного слоя, фибриновое покрытие обеспечило эффективную адгезию эндотелиальных клеток на поверхности полимерных каркасов с увеличением клеточной жизнеспособности, метаболизма и пролиферации (рис. 8). Параллельно это сопровождалось повышением площади покрытия белком фокальной адгезии паксилином и ориентацией структурного белка F-актина в адгезированных эндотелиальных клетках.

 

Рис. 8. Биологические свойства матриксов PHBV/PCL, покрытых различными белками внеклеточного матрикса

 

Высокая способность к удержанию клеток в условиях потока гарантирует сохранность воссозданного на поверхности протеза эндотелиального слоя и, как следствие, поддержание тромборезистентности тканеинженерного протеза после имплантации. Фибрин проявил максимальную способность к удержанию клеток на поверхности биодеградируемых сосудистых протезов при их культивировании в условиях проточного пульсирующего биореактора, что указывает на предпочтительность использования данного белка в тканевой сосудистой инженерии (рис. 9) [35].

 

Рис. 9. Удержание клеток на поверхности биодеградируемых сосудистых протезов PHBV/PCL, покрытых различными белками внеклеточного матрикса, в условиях статики и пульсирующего потока

 

Таким образом, современный уровень развития сосудистой тканевой инженерии, использование биологически активных компонентов и аутологичных составляющих (белков и клеточных элементов) делают реальным создание персонифицированных тканеинженерных сосудистых протезов малого диаметра с проангиогенной активностью, низкой иммуногенностью и возможностью полноценного ремоделирования и адаптивного роста.

В перспективе тканеинженерные сосудистые протезы малого диаметра могут быть успешно применимы в плановой и экстренной сердечно-сосудистой хирургии, нейро- и микрохирургии, военно-полевой сосудистой хирургии.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2022-0001 «Молекулярные, клеточные и биомеханические механизмы патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний в разработке новых методов лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы на основе персонифицированной фармакотерапии, внедрения малоинвазивных медицинских изделий, биоматериалов и тканеинженерных имплантатов».

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. Л.В. Антонова — дизайн и систематизация данных, написание исходного варианта статьи; О.Л. Барбараш — разработка дизайна статьи, экспертиза финального варианта статьи; Л.С. Барбараш — разработка дизайна статьи, утверждение финального варианта статьи. Все авторы внесли значимый вклад в подготовку статьи, прочли финальную версию текста перед публикацией и одобрили направление рукописи на публикацию.

Об авторах

Лариса Валерьевна Антонова

Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний

Автор, ответственный за переписку.
Email: antonova.la@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8874-0788
SPIN-код: 8634-3286

д.м.н.

Россия, Кемерово

Ольга Леонидовна Барбараш

Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний

Email: barbol@kemcardio.ru
ORCID iD: 0000-0002-4642-3610
SPIN-код: 5373-7620

д.м.н., профессор, академик РАН

Россия, Кемерово

Леонид Семенович Барбараш

Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний

Email: reception@kemcardio.ru
ORCID iD: 0000-0001-6981-9661

д.м.н., профессор, академик РАН

Россия, Кемерово

Список литературы

Дополнительные файлы