Изучение генерации синглетного кислорода в слюне человека in vitro под действием наносекундного импульсного лазерного излучения

Полный текст

Обоснование

Открытие немногим более полувека назад принципа генерации и усиления световых волн определило развитие нового направления в медицине с использованием лазерного излучения в лечении различных заболеваний. Воздействие лазерного излучения обусловлено наличием фотоакцепторов в клетках и тканях организма. Широко регулируемые параметры — длина волны, интенсивность, частота, мощность излучения — определяют эффекты воздействия на биологические ткани [2].

Одним из интересных и перспективных направлений в лазерной медицине является фотодинамическая терапия, основанная, с одной стороны, на деструктивном воздействии синглетного кислорода, образующегося в результате каскада фотохимических реакций, а с другой — на биостимулирующем действии низкоинтенсивного лазерного излучения [10]. Молекула синглетного кислорода представляет собой возбужденное состояние за счет поглощения энергии лазерного излучения. Это обусловливает свойства синглетного кислорода как сильнейшего окислителя ароматических аминокислот и его способность к разрушению мембранных структур клетки [4]. Для усиления фотодинамических реакций используют фотосенсибилизаторы, способные аккумулироваться в тканях и несущие в себе большее количество кислородных молекул [2]. Однако низкая фотодинамическая активность, недостаточная селективность, чувствительность к определенной длине волны, высокая токсичность вкупе с высокой стоимостью производства современных фотосенсибилизаторов, например, на основе природных хлоринов ставят вопрос об эффективности их применения [8].

Генерация синглетного кислорода под действием лазерного излучения возможна без использования фотосенсибилизаторов в спектральных интервалах квазимонохроматического излучения ближней инфракрасной области в полосах поглощения газообразного кислорода с максимумом в полосе ~1265 нм [1]. Импульсное лазерное излучение в ультракоротких режимах за счет высокой пиковой мощности глубже проникает в среды без существенного нагрева. Суммирование световых фотонов в наносекундном импульсном режиме излучения способствует насыщению сред синглетным кислородом за счет перекрывания короткого времени жизни этой активной формы [9].

Разработка и построение новых приборов имеют огромное значение для развития медицинских технологий, позволяя повысить качество лечения и добиваться устойчивых положительных результатов. Развитие медицинской лазерной техники идет очень быстрыми темпами. Сегодня создаются новые лазерные приборы на основе диодных технологий для применения в медицине, имеющие компактные размеры и способные к генерации ультракоротких импульсов излучения с возможностью излучения нескольких длин волн. Перспективным представляется разработка робототехнического комплекса для лечения сложной патологии челюстно-лицевой области с возможностью интеграции лазерного модуля в манипуляторы робота-хирурга, с помощью интеллектуального интерфейса которого возможны регулирование скорости движения лазерного инструмента, соблюдение максимально точного расстояния между наконечником лазерного инструмента и тканью, а также регулирование мощности и импульсности лазерного излучения.

Ранее нами в цикле исследований на биохимических модельных средах и в плазме крови была доказана возможность генерации синглетного кислорода без использования фотосенсибилизаторов с применением лазерного излучения наносекундного импульсного квантового генератора в квазимонополосе излучения с длиной волны ~1270 нм [5–7].

Лазерная терапия и микрохирургия в полости рта непосредственно сопряжены с взаимодействием лазерного излучения с ротовой жидкостью. Слюна — биологическая среда организма человека, выделяемая в полость рта слюнными железами. В полости рта образуется смешанная слюна, или ротовая жидкость, которая кроме секрета слюнных желез включает микрофлору и продукты ее жизнедеятельности, содержимое пародонтальных карманов, десневую жидкость, десквамированный эпителий, мигрирующие в полость рта лейкоциты, остатки пищевых продуктов и т.д. На 98,5% и более слюна состоит из воды с содержанием солей различных кислот, микроэлементов, ферментов [3].

По нашему мнению, заслуживает внимания изучение возможности генерации синглетного кислорода в ротовой жидкости человека.

Цель исследования — изучение генерации синглетного кислорода в ротовой жидкости человека in vitro в зависимости от параметров наносекундного импульсного лазерного излучения с длиной волны ~1265 нм.

Методы

Дизайн исследования

Проведено проспективное сравнительное лабораторное исследование. В работе использовалось лазерное устройство (опытный образец), имеющее основной инфракрасный (ИК) излучатель с длиной волны, примерно соответствующей максимуму поглощения кислорода (~1265 нм), с генерацией наносекундного импульсного излучения.

Излучатель монтировался в герметичном корпусе с термостабилизацией на основе элемента Пельтье. Излучение фокусировалось в оптическом световоде диаметром 400 мкм. ИК-излучатель представляет собой полосковый диодный лазер на основе квантоворазмерной двойной гетероструктуры раздельного ограничения [11, 12] с расширенным волноводом [13, 14]. Гетероструктура состояла из двух квантовых ям (КЯ) из твердого раствора InGaAsP (толщиной 50 Å каждая). КЯ были помещены в нелегированный волновод (шириной 0,74 мкм) из InGaAsP. n- и р-эмиттеры изготовлены из InP, легированного до n = 4×10¹⁷ см^–3 и р = 5×10¹⁷ см^–3 соответственно (рис. 1). Длина резонатора Фабри–Перо составляла L = 2 мм, ширина полоскового контакта, обеспечивающего апертуру излучения, — W = 100 мкм.

 

Рис. 1. Схематическая зонная энергетическая диаграмма лазерной структуры, использованной в исследуемом модуле. z — координата вдоль направления роста структуры

 

ИК-излучатель имеет непрерывный режим работы и четыре импульсных режима. Длительность импульса в каждом из режимов — 400 нс, а частота повторения импульсов для режимов 1–4 — соответственно 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 МГц.

Условия проведения

Настоящее исследование выполнено на базе лаборатории медицинской кибернетики и цифровых биомедицинских нанотехнологий НИИ «Технобиомед» ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Исходы исследования

Были получены образцы ротовой жидкости человека (слюна собиралась из ротовой полости в пробирку при стимуляции саливации) и смыва ротовой жидкости (получается при полоскании ротовой полости и содержит примерно 30% (об.) слюны и 70% (об.) воды), которые были предварительно подвергнуты центрифугированию (10 мин при 39 000 об./мин при t = 4 °С) для удаления клеточных элементов. Визуально вязкость образцов существенно различалась. Вязкость ротовой жидкости существенно больше по сравнению с вязкостью смыва.

Для проведения фотохимических экспериментов использовались квадратные кварцевые флуоресцентные кюветы с длиной оптического пути 1 см. Объем проб в кюветах всегда составлял 1,25 мл. Растворы разбавляли детергентом — додецилсульфат натрия (SDS) в небольшой концентрации (0,05 М), что оказалось достаточно для устойчивой солюбилизации ловушки, при этом концентрация ловушки не падала за 1 ч стояния пробы.

Головку световода размещали вплотную к кювете с раствором ловушки. Продолжительность сеанса облучения пробы была подобрана так, чтобы эффект выцветания SDS был достоверно измеримым, но не слишком сильным. Время облучения составило 60 мин со средней мощностью 1 Вт.

Методы регистрации исходов

Для регистрации выцветания ловушки синглетного кислорода использовали спектрофотометр Shimadzu UV-1601PC. По оптической плотности раствора вычисляли скорость выцветания ловушки. Исследование проводили на разных режимах работы лазера с целью выявления оптимальных параметров лазерного излучения для генерации синглетного кислорода.

Статистический анализ

В каждом режиме излучения проводили серию исследований из 50 сеансов. Результаты обрабатывали статистически с вычислением среднего арифметического значения и погрешности среднего арифметического.

Результаты

Основные результаты исследования

В табл. 1 приведены относительные средние скорости выцветания ловушки из 50 независимых измерений в ротовой жидкости, смыве ротовой жидкости и воде с относительной погрешностью под действием лазерного излучения в соответствии со скоростью падения оптической плотности ловушки, нормированной на 1 Вт в 1 мин лазерного облучения.

 

Таблица 1. Сравнение эффективности фотодеструкции ловушки синглетного кислорода в слюне с добавлением детергента при действии исследуемого лазера в сравнении с водой на разных режимах работы

	Скорость выцветания ДФИБФ (отн. ед.), нормированная на мощность лазерного излучения (Вт)
	Среда
Режим работы	Ротовая жидкость + 0,05 М SDS	Смыв ротовой жидкости + 0,05 М SDS	Вода + 0,05 М SDS
Непрерывный	0,0094±0,0001	0,0098±0,0002	0,0076±0,0002
Импульс: • режим 1	0,0105±0,0003	0,0112±0,0002	0,0087±0,0002
• режим 2	0,0113±0,0002	0,0122±0,0003	0,0090±0,0001
• режим 3	0,0126±0,0003	0,0135±0,0002	0,0011±0,0002
• режим 4	0,0138±0,0003	0,0149±0,0003	0,0114±0,0003

 

Из данных табл. 1 видно, что в импульсных наносекундных режимах лазерное излучение более эффективно, чем в непрерывном режиме. Частота повторения импульса в пределах доступного диапазона (0,5–2,0 МГц) оказывает существенное влияние на усиление эффекта. С увеличением частоты повторения наблюдалось повышение эффекта в среднем на 10% по сравнению с меньшей частотой, а эффект с максимальной частотой 2 МГц был практически на 50% выше, чем при использовании непрерывного режима излучения, во всех проведенных исследованиях.

На рис. 2 графически показаны эффекты выцветания ловушки при облучении растворов ротовой жидкости и смыва ротовой жидкости в зависимости от времени облучения лазером в режиме излучения с частотой 2,0 МГц. Уменьшение оптической плотности при 414 нм достоверно отмечалось в образцах со смывом ротовой жидкости, эффект составил 0,07 ± 0,01 за 60 мин облучения (рис. 2, А). В ротовой жидкости эффект при тех же параметрах был чуть ниже, составив 0,05 ± 0,03 (рис.2, Б). При этом в эксперименте контролировали температуру нагрева сред, которая поднялась за 60 мин с 27 до 37 °С, т.е. нагрев растворов составил не более 10 °С, что позволяет утверждать о безопасности термического воздействия лазерного излучения данного модуля. Для сравнения проводили эксперимент в воде, где скорость выцветания ловушки почти такая же, как и в смыве ротовой жидкости.

 

Рис. 2. Серия спектров поглощения химической ловушки в смыве слюны (А) и в ротовой жидкости (Б) с 0,05 М SDS при действии исследуемого лазера в режиме 1 Вт, 1,25 мл

 

Обсуждение

Полученные данные позволяют утверждать, что при использовании лазера с наносекундным импульсным излучением скорость выцветания ловушки в ротовой жидкости и смыве ротовой жидкости сравнима со скоростью выцветания в воде. При этом в смыве ротовой жидкости образование синглетного кислорода 1,3 раза выше, чем в воде. Такой результат можно объяснить присутствием в ротовой жидкости других фотоакцепторов, которые при разведении водой способствуют большей генерации синглетного кислорода при использовании ультракоротких импульсов высокой мощности квазимонохроматического лазерного излучения.

Установлено, что наносекундное лазерное излучение приводит к окислению химической ловушки синглетного кислорода, солюбилизированной детергентом додецилсульфат натрия (0,05 М SDS), в ротовой жидкости и смыве слюны из полости рта. Поскольку молекулы ловушки (SDS) имеют максимум поглощения только в УФ и видимой области спектра и не поглощают инфракрасное лазерное излучение, эффект обусловлен прямым лазерным возбуждением растворенного кислорода, полоса поглощения которого соответствует спектральной области лазерного излучения. В одинаковых условиях эффект выцветания ловушки в ротовой жидкости примерно в 2 раза слабее, что, возможно, обусловлено большим содержанием белка в ротовой жидкости и большей вязкостью этого образца. Однако скорость выцветания ловушки в смыве слюны оказалась в 1,3 раза быстрее, чем в воде с детергентом, что может свидетельствовать об активации фотоакцепторов и перенасыщении их кислородом при использовании водного разведения ротовой жидкости. Максимальный эффект наблюдался при использовании лазерного излучения с частотой повторения импульсов 2,0 МГц.

Заключение

На основании проведенных лабораторных исследований сконструирован лазерный аппарат для использования в стоматологической практике. Изобретения защищены патентами РФ № 2635773 «Лазерный импульсный модуль для комплексной терапии, гипертермии и хирургии заболеваний челюстно-лицевой области» и № 2652565 «Способ лечения одонтогенных заболеваний с использованием лазерной фотодинамической синглетной окситерапии».

В настоящее время создание робототехнической хирургической системы для заместительной и реконструктивной хирургии тканей и органов головы и шеи с возможностью интеграции лазерного модуля является актуальной задачей развития медицины.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследования выполнены, рукопись подготовлена и публикуется за счет финансирования по месту работы авторов.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. О.О. Янушевич — написание текста, проведение исследования, финальная вычитка; И.В. Маев — написание текста, проведение исследования, финальная вычитка; Э.А. Базикян — написание текста, проведение исследования, финальная вычитка; А.А. Чунихин — написание текста, проведение исследования, финальная вычитка. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования, подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Об авторах

Олег Олегович Янушевич

Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова

Email: msmsu@msmsu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0059-4980
SPIN-код: 1452-1387
Scopus Author ID: 57131101200
ResearcherId: AAX-6673-2021

д.м.н., профессор, академик РАН

Россия, 127473, Москва, ул. Делегатская, 20, стр. 1

Игорь Вениаминович Маев

Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова

Email: msmsu@msmsu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6114-564X
SPIN-код: 1994-0933
Scopus Author ID: 7006155179
ResearcherId: N-9320-2014

д.м.н., профессор, академик РАН

Россия, 127473, Москва, ул. Делегатская, 20, стр. 1

Эрнест Арамович Базикян

Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова

Email: bazikyan@msmsu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9184-3737
SPIN-код: 8434-1801
Scopus Author ID: 57205681369
ResearcherId: H-3714-2017

д.м.н., профессор

Россия, 127473, Москва, ул. Делегатская, 20, стр. 1

Андрей Анатольевич Чунихин

Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова

Автор, ответственный за переписку.
Email: docca74@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9054-9464
SPIN-код: 2691-1347
Scopus Author ID: 57192695496
ResearcherId: O-5596-2014

д.м.н., доцент

Россия, 127473, Москва, ул. Делегатская, 20, стр. 1

Список литературы

Дополнительные файлы