The set of PCR-based laboratory methods for molecular diagnostics in oncology

Olga P. Dribnokhodova; Дрибноходова Ольга Павловна; Konstantin O. Mironov; Миронов Константин Олегович; Elena A. Pozdysheva; Поздышева Елена Алексеевна; Michail A. Vinokurov; Винокуров Михаил Андреевич; Vitaly I. Korchagin; Корчагин Виталий Иванович; Vasily G. Akimkin; Акимкин Василий Геннадьевич

doi:10.15690/vramn17937

Комплекс методик для молекулярной диагностики в онкологии

Авторы: Дрибноходова О.П.¹, Миронов К.О.¹, Поздышева Е.А.¹, Винокуров М.А.¹, Корчагин В.И.¹, Акимкин В.Г.¹
Учреждения:
1. Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Выпуск: Том 79, № 6 (2024)
Страницы: 481-489
Раздел: АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ОНКОЛОГИИ
Дата публикации: 15.12.2024
URL: https://vestnikramn.spr-journal.ru/jour/article/view/17937
DOI: https://doi.org/10.15690/vramn17937
ID: 17937

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Определение герминальных мутаций и полиморфизмов, влияющих на процессы онкогенеза, может использоваться в профилактической медицине для выявления лиц, имеющих повышенный риск заболевания, оптимизации скрининговых и профилактических программ, а также в медико-генетическом консультировании. Поиск герминальных и соматических мутаций в опухолях необходим для подтверждения и уточнения диагноза, выбора лекарств и тактики ведения пациента, прогнозирования течения заболевания и мониторинга эффективности его лечения. Изучение индивидуальных фармакогенетических особенностей организма может быть полезно для выбора оптимальной дозировки лекарств и подбора их комбинаций, а также для оценки риска развития побочных реакций. В Центральном НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора разработан комплекс методик для качественного определения герминальных мутаций, приводящих к наследственным опухолевым синдромам, и генетических полиморфизмов, ассоциированных с повышенным риском развития злокачественных новообразований и эффективностью применения лекарств, а также для количественного определения доли мутантного аллеля при соматических мутациях, которые могут использоваться для решения клинических задач в онкологической практике.

Ключевые слова

онкогенетика, соматические мутации, герминальные мутации, генетическая предрасположенность, фармакогенетика

Полный текст

Введение

Онкологические заболевания являются одной из главных проблем современного здравоохранения. В России в 2021 г. было выявлено 580 415 новых случаев и зарегистрировано 278 992 смертей от злокачественных новообразований, распространенность онкологических заболеваний составила 2690,5 на 100 тыс. населения [1]. Возникновение и течение многих злокачественных опухолей связано с генетическими факторами, такими как герминальные мутации, приводящие к наследственным опухолевым синдромам, соматические мутации, ассоциированные со спорадическими опухолями, и генетические полиморфизмы, в первую очередь однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), модифицирующие влияние других онкогенных факторов. Генетический профиль опухоли и организма пациента необходимо учитывать при выборе тактики лечения и оценки прогноза заболевания. Исследование многих соматических и герминальных мутаций включено в инструкции к таргетным противоопухолевым препаратам в качестве показания или противопоказания к назначению. Фармакогенетические исследования позволяют подбирать наиболее эффективную и безопасную для пациента схему применения лекарств и их комбинаций [2–6]. В связи с этим важным направлением молекулярной диагностики в онкологии является определение герминальных и соматических мутаций и ОНП, связанных или ассоциированных с онкогенезом и ответом на терапию.

Выбор оптимального метода для определения мутаций и полиморфизмов зависит от конкретной клинической задачи. Чаще всего применяются методы, основанные на ПЦР в режиме реального времени, имеющие высокую чувствительность, и на секвенировании, позволяющие детектировать и определять как уже известные, так и новые нуклеотидные варианты [7–9].

Разработка доступных высокочувствительных методик, позволяющих выявлять мутации, приводящие к развитию опухоли или возникающие на фоне лечения, и определять индивидуальные генетические особенности организма пациента, необходима для обеспечения возможности проведения молекулярно-генетических исследований как в клинической онкологической практике, так и в эпидемиологических и научных исследованиях.

Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора — один из крупнейших в России высокотехнологичных импортозамещающих биотехнологических предприятий по производству современных изделий для молекулярной диагностики, которые применяются в различных областях научных и клинических исследований [10].

Определение герминальных мутаций

Генетическая предрасположенность — важный фактор риска развития рака молочной железы и рака яичников. К наследственным формам относится до 15–25% случаев рака яичников и 5–10% случаев рака молочной железы. К настоящему времени идентифицирован и достаточно хорошо изучен ряд генов, мутации в которых приводят к данным заболеваниям [11].

Герминальные мутации в генах BRCA1 и BRCA2 ассоциированы с повышенным риском развития рака молочной железы, рака яичников, а также ряда других онкологических заболеваний, таких как рак поджелудочной железы и рак предстательной железы. Для синдрома BRCA-ассоциированного наследственного рака молочной железы и яичников характерны высокий риск развития первично-множественных и повторных опухолей, а также высокая чувствительность к PARP-ингибиторам и ДНК-повреждающим агентам. В российской популяции чаще всего встречается мутация 5382insC в гене BRCA1 (55–80% всех мутаций), также часто встречаются мутации 4153delA, 300T>G, 185delAG, 2080delA, 3819delGTAAA, 3875delGTCT в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2. Определение этих мутаций входит в рекомендации по генетическому тестированию на наследственную предрасположенность к наследственному раку и во многие панели генетического тестирования [11–13].

Мутации в гене CHEK2 приводят к развитию синдрома Ли–Фраумени второго типа и возникновению онкологической патологии различной локализации, чаще всего рака молочной железы. Мутации в гене NBN в гомозиготном состоянии приводят к развитию синдрома Ниймегена, повышенной чувствительности к ионизирующему излучению и предрасположенности к онкологическим заболеваниям, особенно лимфомам. Данные о предрасположенности гетерозиготных носителей к раку молочной железы и яичников в настоящее время противоречивы [11, 14–16].

Методики для определения мутаций 5382insC (rs80357906), 4153delA (rs80357711), 300T>G (C61G, rs28897672), 2080delA (rs80357522) и 185delAG (rs80357914) в гене BRCA1 и мутации 6174delT (rs80359550) в гене BRCA2 методом пиросеквенирования имеют регистрационное удостоверение и успешно применяются на практике [17–19].

Также для определения мутаций 5382insC, 4153delA, 300T>G, 185delAG, 3819delGTAAA (rs80357609) и 3875delGTCT (rs80357868) в гене BRCA1, 6174delT в гене BRCA2, 1100delC (rs555607708) в гене CHEK2 и 657delG(T)4 (rs587776650) в гене NBN разработаны методики, основанные на ПЦР в режиме реального времени (рис. 1).

Рис. 1. Пример выявления мутации 657delG(T)4 (rs587776650) в гене NBN: А — результаты ПЦР в режиме реального времени по каналу Green (детектируется аллель без мутации, 657G(T)4); Б — результаты ПЦР в режиме реального времени по каналу Yellow (детектируется мутация, 657delG(T)4); В — результаты пиросеквенирования. Анализируемые образцы: 1 — мутация 657delG(T)4 не обнаружена, генотип 657G(T)4/657G(T)4; 2 — мутация 657delG(T)4 обнаружена в гетерозиготном состоянии, генотип 657G(T)4/657delG(T)4; 3 — мутация 657delG(T)4 обнаружена в гомозиготном состоянии, генотип 657delG(T)4/657delG(T)4

Выявление этих мутаций у онкологических пациентов может служить для подтверждения диагноза синдрома наследственного рака молочной железы и яичников, выбора оптимального лечения и оценки риска развития повторных опухолей. Диагностика наследственных опухолевых синдромов до развития заболевания позволяет проводить медико-генетическое консультирование, оптимизировать скрининг и выполнять своевременную профилактику для лиц, относящихся к группе высокого риска развития онкологических заболеваний [11, 12].

Определение соматических мутаций в солидных новообразованиях

Одним из наиболее изученных сигнальных путей, нарушение которых приводит к развитию онкологических заболеваний, является сигнальный путь MAPK/ERK, который участвует в регуляции пролиферации, апоптоза и способности клеток к дифференцировке. Нарушение пути MAPK/ERK лежит в основе значительной части наиболее распространенных онкологических заболеваний. Активирующие соматические мутации в генах KRAS, HRAS и NRAS выявляются в 20–30% всех злокачественных новообразований, мутации гена BRAF — в 6–8% [20]. Для отдельных типов опухолей, таких как меланома, рак толстого кишечника, щитовидной железы, частота мутаций в этих генах намного выше. При этом частота и спектр наблюдаемых мутаций для разных опухолей сильно отличаются, например, мутации в 600-м кодоне BRAF характерны для папиллярного рака щитовидной железы, а K601E и мутации в генах RAS — для фолликулярных опухолей и фолликулярного варианта папиллярного рака, что позволяет использовать определение этих мутаций для уточнения диагноза при неопределенном цитологическом заключении тонкоигольной аспирационной биопсии [21–24].

Разработанный комплекс методик для определения соматических мутаций методом пиросеквенирования позволяет определять все клинически значимые мутации в 592–601-м кодонах гена BRAF, 12-м и 13-м кодонах гена KRAS, 12-м, 13-м и 61-м кодонах генов HRAS и NRAS и количественно измерять долю мутантного аллеля. Методики обеспечивают достаточную чувствительность для выявления частых мутаций в 600-м и 601-м кодонах гена BRAF, позволяют их дифференцировать, а также определять редкие мутации в секвенируемых участках генов [8, 25–27].

Наличие мутаций в этих генах ассоциировано с резистентностью опухоли к таргетным препаратам, направленным на ингибирование предшествующих компонентов сигнального пути MAPK/ERK (например, ингибиторам EGFR при раке легкого и толстого кишечника), и с чувствительностью опухоли к препаратам, специфически ингибирующим мутантные варианты белка (например, к ингибиторам мутантного BRAF и комбинациям ингибиторов BRAF и MEK при наличии мутаций в гене BRAF), что делает необходимым определение мутационного статуса опухоли для выбора терапии [5, 24, 28, 29]. В ряде случаев требуется определять не только наличие мутации, но и ее тип, ингибиторы мутантного BRAF более эффективны в отношении мутации 600-го кодона, а препарат соторасиб специфически ингибирует белок KRAS с мутацией G12C и неактивен в отношении других мутаций [24, 30, 31].

Также для ряда опухолей было показано, что наличие мутаций в 600-м кодоне гена BRAF и мутаций в генах RAS ассоциировано с более агрессивным фенотипом опухоли и более высоким риском рецидива и метастазирования, что может использоваться при выборе тактики лечения и прогнозировании течения заболевания [24, 28–30].

Определение соматических мутаций в онкогематологии

В соответствии с классификацией Всемирной организации здравоохранения и клиническими рекомендациями для диагностики Ph-негативных хронических миелопролиферативных заболеваний (Ph-МПЗ), к которым относятся истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия и первичный миелофиброз, обязательным диагностическим критерием является выявление драйверных соматических мутаций в генах JAK2, MPL и CALR [32, 33]. Выявление драйверных соматических мутаций свидетельствует о клональной природе патологического процесса, что позволяет дифференцировать нозологии Ph-МПЗ от ряда других миелоидных неоплазий, вторичных эритроцитозов и тромбоцитозов, а также прогнозировать течение болезни и вести мониторинг лечения. Доля пациентов с истинной полицитемией, у которых выявляется мутация V617F в 14-м экзоне гена JAK2, достигает 96%, еще у 2% наблюдаются мутации в 12-м экзоне. Мутации гена CALR наблюдаются у 67–88% пациентов с эссенциальной тромбоцитемией и первичным миелофиброзом и практически не встречаются у пациентов с истинной полицитемией.

Комплекс разработанных методик и алгоритмов дифференцирования и количественной оценки аллельной нагрузки обнаруженной мутации позволяет выявлять и определять количественно как самые частые, так и редкие мутации, характерные для Ph-МПЗ: мутации в 531–547-м и 617-м кодонах гена JAK2, в 505–519-м кодонах гена MPL и в 367–385-м кодонах гена CALR. Предел аналитической чувствительности данных методик, основанных на пиросеквенировании, составил 3–5%, что достаточно для лабораторной диагностики Ph-МПЗ, поскольку при первичном выявлении клинически развернутого миелопролиферативного заболевания уровень аллельной нагрузки драйверных мутаций, как правило, превышает 5%. В случае необходимости детекции мутантных аллелей на фоне избыточной концентрации интактной ДНК возможно использование модификации методик, основанной на аллель-специфической ПЦР [34–37].

Разработанный комплекс методик позволяет достаточно быстро и надежно выявлять любые варианты соматических мутаций, которые могут встречаться на секвенируемых участках 12-го экзона гена JAK2, 10-го экзона гена MPL и в 9-м экзоне гена CALR, в том числе ранее неописанных, проводить мониторинг количественной оценки аллельной нагрузки в динамике развития заболевания, а также подтверждать мутации, определенные с использованием других основанных на ПЦР методов детекции аллелей [38–41].

Генетические полиморфизмы, влияющие на риск развития онкологических заболеваний (на примере рака шейки матки)

Предрасположенность к онкологическим заболеваниям определяется взаимодействием факторов окружающей среды и индивидуальной генетической предрасположенности, которая складывается из действия генов, ассоциированных с повышенным риском определенных видов рака, и полиморфизмов, модифицирующих воздействие других онкогенных факторов.

В основе развития рака шейки матки (РШМ) лежит инфицирование вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска. Тем не менее у ВПЧ-положительных женщин частота РШМ составляет всего 0,015%, что позволяет предполагать наличие генетической предрасположенности к данному заболеванию [42]. На роль факторов, модифицирующих риск развития онкопатологии, рассматривается большое количество различных генов-кандидатов. По результатам метаанализа исследований по полногеномному скринингу ассоциаций (GWAS) и исследований «случай–контроль» наиболее статистически значимую взаимосвязь у европеоидов показали следующие ОНП: rs138446575 в гене TTC34; rs55986091 в HLA-DQB1; rs2910164 в MIR146A; rs1048943 в CYP1A1; rs2516448 в MICA; rs9271898 в HLA-DQA1; rs73728618 в HLA-DQA1; rs10175462 в PAX8; rs1801133 в MTHFR; rs4646903 в CYP1A1 [43].

При репликации результатов на российской популяции rs55986091 в HLA-DQB1 также показал устойчивую статистически значимую ассоциацию как с развитием РШМ, так и c дисплазиями высокой степени (CIN2, CIN3). Показан протективный эффект аллеля rs55986091-A: показатель отношения шансов при сравнении ВПЧ-отрицательных женщин и женщин с РШМ был равен 0,4 (95%-й ДИ: 0,25–0,65) [44].

Полученные данные о наследственных изменениях наряду с другими факторами дадут возможность учесть повышенный риск заболевания для каждого конкретного пациента.

Результаты генетического анализа, определяющего риск развития РШМ и тяжелой дисплазии, могут быть использованы вместе с данными других исследований, таких как анализ на ВПЧ и цитологическое исследование, в процессе скрининга РШМ. Это поможет оценить индивидуальный риск, выявить группы риска и скорректировать периодичность проведения цервикального скрининга.

Однако важно понимать, что даже при суммарно низком генетическом риске не исключается возможность развития онкологии, так как наличие аллеля, ассоциированного с заболеванием, не является основанием для постановки диагноза. Поэтому оценка генетического риска может быть полезна только в сочетании с другими факторами, такими как длительность инфекции, возраст, инфекции, передаваемые половым путем, курение и др. [45]. Лечащий врач может использовать эту информацию при определении дальнейшей тактики ведения пациентки, учитывая все эти факторы, а также получить согласие и информировать пациентку о возможных рисках и последствиях [46].

В настоящее время разрабатывается программное обеспечение для комплексной оценки риска онкологических заболеваний шейки матки. Также проводятся исследования для подтверждения полученных результатов на других группах населения, проживающих на территории Российской Федерации. Аналогичный подход может быть использован для определения риска других видов рака.

Фармакогенетические исследования

Реакция организма на применение различных лекарств в значительной степени зависит от его генетических особенностей, таких как состояние систем биотрансформации и особенности белков-транспортеров, определяющих основные параметры фармакокинетики. В настоящее время для многих препаратов разработаны клинические рекомендации по особенностям дозировки и применения лекарств в зависимости от генетических факторов [5].

Разработанный комплекс методик позволяет определять методом пиросеквенирования ОНП в генах первой и второй фаз биотрансформации (CYP1А1, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP4F2, NAT2, EPHX1, GSTP1, TPMT, UGT1A1), влияющих на активность кодируемых этими генами ферментов, а также полиморфизмы в генах белков-транспортеров ABCB1 и ABCG2.

Гены семейства цитохрома Р450 кодируют ряд ферментов, которые участвуют в метаболизме широкого спектра лекарственных препаратов, в том числе используемых в онкологической практике. Многие ОНП в этих генах ассоциированы с уровнем активности соответствующих ферментов, что может влиять на скорость метаболизма их субстратов. Например, CYP2D6 преобразует анальгетики трамадол и кодеин в активные метаболиты. У носителей неактивных аллелей CYP2D6 при назначении стандартной дозы может наблюдаться недостаточная эффективность препарата, в то время как при наличии аллелей с повышенной активностью повышен риск тяжелых побочных эффектов, в связи с чем рекомендуется избегать назначения этих препаратов у таких пациентов [5].

Методика для определения количества ТА-повторов в промоторе гена UGT1A1 позволяет определять аллели с 5, 6, 7 и 8 TA-повторами (rs8175347). Увеличение числа повторов приводит к снижению эффективности транскрипции и уровня экспрессии фермента, может быть причиной развития гипербилирубинемии и приводить к повышенному риску развития нежелательных лекарственных реакций при назначении ряда лекарственных препаратов, например атазанавира и белиностата, что требует корректировки стартовой дозы. Определение этого полиморфизма используется для дифференциальной диагностики гипербилирубинемий и подтверждения диагноза синдрома Жильбера. Генотип по rs8175347 рекомендуется учитывать при назначении препаратов, ингибирующих UGT1A1, так как это может вызывать усиление побочных эффектов от метаболизируемых этим ферментом лекарств, повышение уровня билирубина и усиление симптоматики синдрома Жильбера [5, 47–50].

Нарушение активности системы биотрансформации приводит к повышенному риску развития нежелательных лекарственных реакций или снижению эффективности терапии, а также должно учитываться при одновременном назначении препаратов, влияющих на активность ферментов и ими метаболизируемых.

Р-гликопротеин, кодируемый геном ABCB1, — один из важнейших транспортеров ксенобиотиков и в том числе многих лекарственных препаратов. Он участвует во всасывании, распределении в организме и экскреции лекарств и является одним из важнейших компонентов гематоэнцефалического барьера. Полиморфизмы в генах белков-транспортеров могут влиять на их уровень экспрессии и субстратную специфичность, снижение их эффективности или повышение риска побочных эффектов, а также предрасположенность к развитию различных заболеваний, в том числе онкологических [5, 51].

Фармакогенетическое тестирование может применяться во всех областях медицины для выбора наиболее эффективных и безопасных для конкретного пациента препаратов, подбора оптимальной дозировки, оценки и снижения риска возможных нежелательных лекарственных реакций, предсказания лекарственных взаимодействий при одновременном назначении нескольких лекарственных средств.

Заключение

Комплекс разработанных методик для качественного определения герминальных мутаций и генетических полиморфизмов, а также количественного определения доли мутантного аллеля соматических мутаций с использованием пиросеквенирования и ПЦР в режиме реального времени направлен на решение различных диагностических, лечебных и профилактических задач в сфере онкологии [57]. В табл. 1 представлены разработанные методики, классифицированные по области применения и их использования в качестве медицинских изделий, а также научные публикации, посвященные результатам их применения.

Разработки ЦНИИ Эпидемиологи для онкогенетики

Направление исследований	Наборы реагентов и методики	Публикации
Определение герминальных мутаций	«BRCA-скрин» (9)* «АмплиСенс BRCA1-FL» «АмплиСенс NBS-FL» «АмплиСенс CHEK2-FL»**	[18, 19, 52]
Определение соматических мутаций в солидных новообразованиях	Методики для определения мутаций в генах BRAF, KRAS, HRAS и NRAS	[8, 25–27]
Определение соматических мутаций в онкогематологии	«ТРОМБО-скрин» (8). Методики для определения мутаций в генах JAK2, MPL* и CALR	[34–36, 40, 53]
Полиморфизмы, влияющие на риск развития онкологических заболеваний	Методика для определения полиморфизма в гене HLA-DQB1. Методика для определения гаплотипа JAK246/1	[43, 44, 54]
Фармакогенетические исследования	«ФАРМА-скрин-1» (16)* «ФАРМА-скрин-2а» (17)* «ФАРМА-скрин-2б» (18)* «ФАРМА-скрин-транспорт» (19)* «ФАРМА-скрин-Варфарин» (20)* «ФАРМА-скрин-Иматиниб» (21)* «АмплиСенс Пироскрин UGT1A1-скрин»***	[47, 48, 51, 55, 56]

*Формы комплектации набора реагентов «АмплиСенс Пироскрин» — регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13246 от 19.03.2012, в скобках указан номер формы комплектации.

**Набор реагентов проходит процедуру регистрации.

***Регистрационное удостоверение № РЗН 2016/4339 от 28.06.2016, № РЗН 2016/4339 от 17.10.2022.

Разработанные методики используются как в исследованиях генетических полиморфизмов и мутаций в российской популяции, так и в диагностических лабораториях. Методики определения герминальных мутаций применяются для диагностики и выбора тактики лечения ряда онкологических заболеваний в соответствии с актуальными клиническими рекомендациями [22, 33, 57]. Определение аллелей ОНП может быть использовано для фармакогенетического тестирования, направленного на повышение эффективности и безопасности назначения лекарств, а также для определения индивидуальных рисков развития или неблагоприятного течения заболеваний. В сочетании с другими распространенными методами диагностики использование данного комплекса методик позволяет повысить эффективность персонализированных подходов в медицине.

Дополнительная информация

Источник финансирования. В 2021–2023 гг. исследование выполнялось в рамках темы НИОКР государственного задания «Изучение генетической предрасположенности к мультифакторным заболеваниям» (рег. № AAAA-A21-121011890130-7).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. В работе использованы наборы реагентов и реактивы «АмплиСенс» производства ФБУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Участие авторов. О.П. Дрибноходова — разработка и практическое применение методик, написание статьи; К.О. Миронов — постановка задач исследования, разработка методик, написание статьи; М.А. Винокуров — разработка и практическое применение методик, написание статьи; Е.А. Поздышева — разработка и практическое применение методик, написание статьи; В.И. Корчагин — статистическая обработка данных, написание статьи; В.Г. Акимкин — общее руководство исследованием, прочел и одобрил направление рукописи на публикацию. Все авторы статьи внесли существенный вклад в организацию и проведение исследования, прочли и одобрили окончательную версию рукописи перед публикацией.