Features of the Gut Microbiota in Patients with Polycystic Ovary Syndrome

Full Text

Обоснование

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) — наиболее распространенная эндокринопатия, частота которой может достигать 20% [1]. Согласно Роттердамским критериям, СПКЯ диагностируется при наличии хотя бы двух из трех классических признаков: гиперандрогении, олиго-/ановуляции и поликистозных яичников по УЗИ. СПКЯ ассоциирован не только с нарушениями менструального цикла, гирсутизмом и бесплодием, но и с метаболическими нарушениями, в основе которых лежит инсулинорезистентность, а также хроническим субклиническим воспалением [2]. В последнее время в центре внимания исследователей находится вопрос о роли нарушений кишечной микробиоты (КМ) в генезе инсулинорезистентности и развитии СПКЯ. Первые исследования в этой области свидетельствовали о связи КМ с ожирением, сахарным диабетом 2-го типа (СД2) и метаболическим синдромом [3–5]. Наиболее изучена связь КМ с ожирением, СД2 и метаболическим синдромом. Обнаружено снижение количества Firmicutes и Clostridium у больных метаболическим синдромом по сравнению со здоровыми людьми, а также увеличение количества жировой ткани у стерильных мышей после пересадки КМ от мышей с ожирением [6].

В 2012 г. K. Tremellen и K. Pearce предложили теорию, согласно которой дисбиоз КМ, возникший вследствие погрешностей в диете, может приводить к дисфункции кишечного барьера и эндотоксемии с последующим развитием хронического субклинического воспаления, инсулинорезистентности и гиперандрогении, характерной для СПКЯ [7]. В дальнейшем подтверждение этой теории получено как на мышиных моделях, так и у людей [8–11]. Однако результаты исследований немногочисленны и противоречивы.

Дискуссионным является вопрос о возможности коррекции эндокринно-метаболических нарушений при СПКЯ путем влияния на состав КМ. В литературе обсуждается потенциальная роль метформина, пробиотиков и трансплантации КМ от здоровых доноров в терапии СПКЯ [12].

Все это определяет целесообразность поиска новых звеньев патогенеза и совершенствования подходов к терапии СПКЯ.

Цель исследования — провести сравнительный анализ состава КМ пациенток с СПКЯ и здоровых женщин, оценить связь различных групп микроорганизмов с маркерами хронического воспаления.

Методы

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое одномоментное исследование. В исследование включено 118 женщин с СПКЯ (основная группа) и 30 здоровых женщин (группа сравнения), сопоставимых по возрасту и индексу массы тела (ИМТ) (рис. 1).

 

Рис. 1. Блок-схема отбора участников исследования

 

Критерии соответствия

Критерии включения в основную группу:

• возраст от 18 до 40 лет;
• СПКЯ, диагностированный по Роттердамским критериям 2003 г.;
• наличие подписанного информированного согласия.

Критерии невключения в основную группу:

• тяжелые соматические заболевания;
• системные аутоиммунные заболевания;
• прием гормональной и антибактериальной терапии менее чем за 3 мес до включения в исследование.

Критерии включения в группу сравнения:

• возраст от 18 до 40 лет;
• отсутствие признаков СПКЯ;
• наличие подписанного информированного согласия.

Критерии невключения в группу сравнения:

• наличие минимум одного из трех Роттердамских критериев СПКЯ 2003 г.;
• тяжелые соматические заболевания;
• системные аутоиммунные заболевания;
• прием гормональной и антибактериальной терапии менее чем за 3 мес до включения в исследование.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе ФГБУ «НМИЦ АГП имени  академика В.И. Кулакова» Минздрава России.

Продолжительность исследования

Исследование продолжалось с 2019 по 2022 г.

Описание медицинского вмешательства

Всем участницам проведено общее клинико-анамнестическое обследование с расчетом ИМТ (вес/рост²). С целью постановки диагноза, согласно клиническим рекомендациям Минздрава России, проводилось исследование гормонального профиля на 2–3-й день менструального цикла и УЗИ органов малого таза на 5–7-й день менструального цикла [13]. Всем участницам проводились определение содержания С-реактивного белка (СРБ), интерлейкина-1β (IL-1β), интерлейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухолей (TNF-α) в сыворотке крови и оценка состава КМ.

Анализ в подгруппах

Сравнение состава КМ проводилось между основной группой — пациентки с СПКЯ и группой сравнения — здоровые женщины, сопоставимые по возрасту и ИМТ.

Методы регистрации исходов

Определение содержания IL-1β, IL-6 и TNF-α в образцах сыворотки периферической крови выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем АО «Вектор-Бест» (Россия) и планшетного спектрофотометра Infiniti F50 TECAN. Исследование СРБ проводили турбидиметрическим методом на автоматическом анализаторе BA-400 (Biosystems, Испания).

Оценка состава КМ проводилась культуральным методом с использованием элементов культуромики, позволяющей выделять максимально возможное количество микроорганизмов, и их последующей идентификацией методом матрично-активированной лазерной деcорбционно/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS).

При проведении исследования участники не принимали препараты, способные повлиять на микробиоту: противодиарейные, потивогельминтные, антибиотики (в течение последних 3 мес), слабительные, нестероидные противовоспалительные препараты, лечебные и очищающие клизмы. Отбиралась проба кала после естественной дефекации, исключая попадание мочи в биоматериал. Критерием включения в исследование были женщины с оформленным или кашице- образным характером кала, без признаков диареи. Кал собирали в предварительно подготовленную сухую чистую емкость на стерильный лист бумаги, откуда отбирался образец кала в стерильный пластиковый контейнер в количестве 8–10 см³ (~2 чайные ложки) при помощи специальной «ложки» встроенной в крышку контейнера. Учитывая присутствие строгих анаэробов в биообразце, контейнер с неплотно закрытой крышкой помещался в пластиковый пакет с газогенерирующим составом для создания анаэробиоза (AnaeroGen, Termo Scientific) в соответствии с инструкцией. Биоматериал доставлялся в лабораторию в короткие сроки (не позднее 2 ч после сбора фекалий).

В основе культурального исследования использован метод изучения микробиоты просвета толстой кишки, разработанный В.М. Бондаренко, В.Г. Лиходед [14]. Сущность метода заключается в мерном посеве 10-кратных разведений кала в физиологическом растворе на универсальные, селективные и дифференциально-диагностические среды, позволяющие выделить чистые культуры микроорганизмов и определить количество каждого вида в 1 г биологического материала. Из образцов кала отвешивали 1 г на аналитических весах, добавляли 9 мл физиологического раствора, получая исходное разведение материала (10^–1), гомогенизировали в течение 5–10 мин с помощью вихревого смесителя, затем готовили ряд 10-кратных разведений в стерильном физиологическом растворе от 10^–2 до 10^–9. Из полученных разведений производили посев 0,1 мл суспензии в чашки Петри с агаризованными питательными средами и растирали стерильным шпателем от большего разведения к меньшему.

Для работы с облигатными анаэробами сразу после доставки в лабораторию биоматериал помещали в анаэробный бокс, из середины образца отбирали его часть, взвешивали, готовили серию 10-кратных разведений в прередуцированном физиологическом растворе и проводили посев в условиях анаэробного бокса.

Для выделения факультативно-анаэробных и аэробных бактерий использовали колумбийский кровяной агар, хромогенную среду Brilliance, сальмонелла-шигелла-агар, декстрозный агар, среду для выявления и дифференциации Streptococcus agalactiae (CHROMagar, Франция), маннит-солевой агар (Himedia, Индия), энтерококковый агар, агар Эндо (ФГУН «ГНЦ ПМБ», Россия) и для грибов — агар Сабуро (Oxoid, Великобритания). Лактобациллы культивировали на лактобакагаре (ФГУН «ГНЦ ПМБ», Россия). Облигатные анаэробы выделяли на прередуцированном агаре Шедлера с необходимыми добавками, основном агаре для анаэробов, железосульфитном агаре, перфрингенс агаре, селективном агаре для Clostridium difficile (Oxoid, Великобритания). Бифидобактерии культивировали на агаре для бифидобактерий (Himedia, Индия).

Для культивирования микроаэрофилов использовали СО₂-инкубатор (Jouan, Франция) (концентрация СО₂ — 5%). Строгие анаэробы выращивали в анаэробном боксе (Whitley DG 250 Anaerobic Workstation, Великобритания) в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (N₂ — 80%; CO₂ — 10%; Н₂ — 10%). Грибы инкубировали в термостате при 30 °С в течение 5 дней. Идентифицировали микроорганизмы методом MALDI-TOF MS с помощью масс-спектрометра AutoFlex III c программным обеспечением Maldi BioTyper (Bruker Daltoniks, Германия), версия 4.0. Микроорганизм считали идентифицированным до вида с высокой степенью вероятности при значениях SCORE ≥ 2,0. У трудноидентифицируемых культур (значение SCORE < 2,0) проводили секвенирование участка гена 16S рРНК. ДНК культур выделяли с использованием набора реагентов для выделения ДНК «Проба-ЦиТо» («ДНК-технология», Россия). После культивирования проводили подсчет количества каждого вида микроорганизма (с учетом видовой идентификации) в 1 г биоматериала по числу колоний, выросших на питательных средах, с пересчетом на количество посевного материала и степени его разведения по формуле

М = Р × 10ⁿ⁺¹,

где М — число микроорганизмов в 1 г биологического материала пациента; Р — число колоний; n — разведение.

Этическая экспертиза

Исследование одобрено комиссией по этике биомедицинских исследований при ФГБУ «НМИЦ АГП имени  В.И. Кулакова» Минздрава России (протокол заседания № 8 от 31 октября 2019 г.).

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки. Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных. Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS (IBM Statistical Package for the Social Sciences, версия 21). Для количественных показателей рассчитаны: среднее значение (М), среднеквадратическое отклонение (SD), медиана (Ме), интерквартильный размах (Q_25%; Q_75%). Для качественных и порядковых показателей — частоты (%). Числовые параметры, имеющие нормальное распределение, представлены в формате М (SD), параметры, имеющие распределение, отличное от нормального, — в формате Ме (Q_25%; Q_75%). Для нахождения различий между группами пациентов для нормально распределенных числовых показателей использовали критерий ANOVA (для нескольких групп) и затем применяли попарное сравнение групп с помощью t-критерия Стьюдента для двух независимых выборок. В случае неподтверждения гипотезы о нормальном распределении для сравнения количественных данных применяли непараметрические методы Краскела–Уоллиса (для нескольких групп) и затем осуществляли попарное сравнение групп с помощью метода U-критерия Манна–Уитни для несвязанных совокупностей.

Для оценки видового богатства рассчитывался индекс Маргалефа по формуле

D_Mg = (S – 1 )/lnN,

где S — число выявленных видов; N — общее число особей всех S видов.

Для сравнения дихотомических показателей между независимыми выборками и установления достоверных различий между ними использовали метод Хи-квадрат с поправкой Йейтса на непрерывность.

Корреляционный анализ проводился с помощью метода Пирсона (для нормально распределенных параметров). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты

Объекты (участники) исследования

Клиническая характеристика участниц исследования представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика пациенток с синдромом поликистозных яичников и группы сравнения

Показатель	Значение показателя в группах
	СПКЯ (n = 118)	Группа сравнения (n = 30)	р - значение
Возраст, лет	25,2 (5,6)*	27,1 (6,4)*	>0,05
ИМТ, кг/м2	24,2 (5,1)*	24,5 (5,0)*	>0,05
Избыточная масса тела, абс. (%)	19 (16,1)	5 (16,7)	>0,05
Ожирение, абс. (%)	19 (16,1)	6 (20,0)	>0,05
Аменорея, абс. (%)	22 (18,6)	0	0,005
Олигоменорея, абс. (%)	96 (81,4)	0	<0,001
Биохимическая гиперандрогения, абс. (%)	90 (76,3)	0	<0,001

Примечание. * — М (SD). СПКЯ — синдром поликистозных яичников; ИМТ — индекс массы тела.

Основные результаты исследования

Результаты изучения КМ обследуемых женщин показали, что большинство микроорганизмов среди царства прокариот относилось к четырем типам: Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria и Actinobacteria. У пациенток с СПКЯ (см. рис. 1) среди Firmicutes встречались микроорганизмы 23 родов, при этом наиболее часто — Enterococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Clostridium и Veillonella. В составе Actinobacteria были микроорганизмы 15 родов с доминированием по частоте выделения Bifidobacterium и Corynebacterium. Тип Proteobacteria включал 22 рода, среди которых чаще обнаруживали бактерии родов Escherichia, Klebsiella и Citrobacter. Среди Bacteroidetes встречались микроорганизмы 6 родов с преобладанием по частоте выделения 3 родов: Bacteroides, Parabacteroides и Prevotella. Реже встречались микроорганизмы двух типов, принадлежащие к царству Fungi: Ascomycota (11 родов), в том числе грибы рода Candida, и Basidiomycota (3 рода).

 

Рис. 2. Состав микробиоты кишечника у женщин с синдромом поликистозных яичников

 

У здоровых женщин КМ представлена микроорганизмами тех же четырех типов. Среди Firmicutes встречались микроорганизмы 11 родов, наиболее часто — Enterococcus, Lactobacillus и Clostridium, среди Actinobacteria — 6 родов с доминированием по частоте выделения Bifidobacterium и Corynebacterium. Тип Proteobacteria включал 7 родов, среди которых чаще обнаруживали Escherichia и Klebsiella, тип Bacteroidetes — 5 родов с преобладанием Bacteroides и Prevotella.

Суммарно выделены микроорганизмы 51 семейства, 80 родов и 320 видов. На рис. 2 представлен состав основных филотипов КМ у пациенток с СПКЯ, на рис. 3 — у здоровых женщин.

 

Рис. 3. Состав микробиоты кишечника у здоровых женщин

 

По результатам культурального исследования проведено сравнение видового богатства в группах СПКЯ и сравнение с помощью индекса Маргалефа. Выявлено статистически значимо более высокое видовое богатство в группе сравнения (4,3 (3,5; 5,6)) в отличие от пациенток с СПКЯ (3,0 (2,4; 3,9)) (рис. 4).

 

Рис. 4. Видовое богатство кишечной микробиоты у пациенток с синдромом поликистозных яичников и в группе сравнения (индекс Маргалефа)

Примечание. *** p-value < 0,001, тест Манна–Уитни.

 

Сравнительный анализ наиболее часто встречаемых групп микроорганизмов в составе КМ у пациенток с СПКЯ и в группе сравнения представлен на рис. 5.

 

Рис. 5. Частота встречаемости основных групп микроорганизмов у пациенток с синдромом поликистозных яичников и в группе срав- нения

Примечание. *p < 0,05, Хи-квадрат; СПКЯ — синдром поликистозных яичников; НГОБ — неферментирующие грамотрицательные бактерии; КОС — коагулазоотрицательные стафилококки.

 

Установлено, что в отличие от группы сравнения при СПКЯ частота встречаемости энтеробактерий, кроме Escherichia coli (E. coli) (гамма-Proteobacteria), стрептококков, энтерококков, стафилококков (Staphylococcus aureus и коагулазоотрицательных), клостридий (тип Firmicutes), а также микроскопических грибов была выше. Напротив, у здоровых женщин наблюдалась большая частота выделения бифидобактерий (тип Actinobacteria), лактобацилл (тип Firmicutes), кишечной палочки (тип гамма-Proteobacteria), бактероидов (тип Bacteroidetes) и прочих облигатных анаэробов. Однако статистически значимые отличия касались прочих энтеробактерий (Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella) (р = 0,012), Enterococcus (р = 0,02) и грибов (р = 0,02), которые в 1,5–2,0 раза чаще встречались при СПКЯ, а также вида E. coli (р = 0,002) и рода Lactobacillus (р = 0,005), частота встречаемости которых была в 1,5 раза выше в группе сравнения.

Результаты оценки качественного и количественного состава КМ обобщены на тепловой карте (рис. 6).

 

Рис. 6. Тепловая карта состава кишечной микробиоты пациенток с синдромом поликистозных яичников и здоровых женщин

Примечание. СПКЯ — синдром поликистозных яичников; КМ — кишечная микробиота. Представлено графическое изображение количественного и качественного состава КМ пациенток с СПКЯ и здоровых женщин. Каждая тонкая горизонтальная линия представляет собой состав КМ у одной женщины (титр микроорганизмов в lg КОЕ/г обозначен цветом).

 

Из тепловой карты следует, что в составе КМ у пациенток с СПКЯ в отличие от группы сравнения выявлено статистически значимое повышение частоты встречаемости условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), относящихся к порядку Burkholderiales (p = 0,033) (преимущественно Sutterella и Сomamonas), энтеробактерий, за исключением E. coli (Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella) (р = 0,012) и Enterococcus (р = 0,02). Более низкая частота встречаемости была отмечена у представителей рода Parabacteroides (р = 0,01), Veillonella (р = 0,01), Escherichia (р = 0,002) и Lactobacillus (р = 0,005) при СПКЯ в отличие от группы сравнения. У пациенток с СПКЯ также обнаружено повышение численности представителей семейства Enterobacteriaceae, отличных от E. coli, (6 (6,0; 6,8) и 4,5 (3,7; 5,3), p = 0,043). Кроме того, при СПКЯ статистически значимо более высокая степень обсемененности желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) отмечена для рода Erysipelatoclostridium (p = 0,004). В группе сравнения отмечены более высокие титры бактерий из группы комменсалов — родов Bacteroides, Lactobacillus и Escherichia по сравнению с пациентками с СПКЯ (табл. 2).

 

Таблица 2. Статистически значимые отличия количественных показателей бактерий у пациенток с синдромом поликистозных яичников и здоровых женщин

Микроорганизм	Количество бактерий (медиана (ИКР), lg КОЕ/г)		p-value
	Пациентки с СПКЯ	Группа сравнения
Erysipelatoclostridium ramosum	8 (7,0; 8,3)	6 (6,0; 6,0)	0,004
Staphylococcus aureus	7 (6,0; 8,0)	5 (4,5; 6,0)	0,034
Escherichia coli	7 (7,0; 9,0)	8 (7,3; 9,8)	<0,001
Bacteroides caccae	9 (8,0; 10,0)	10 (9,3; 10,0)	0,006
Bacteroides eggerthii	9 (9,0; 10,5)	10 (10,0; 10,0)	<0,001
Bacteroides vulgatus	9 (8,0; 10,5)	10 (8,5; 11,0)	0,03
Lactobacillus gasseri	5 (5,0; 6,0)	6 (5,5; 6,0)	0,01
Lacticaseibacillus rhamnosus	4 (4,0; 4,8)	5 (4,25; 6,0)	0,043

Примечание. СПКЯ — синдром поликистозных яичников.

 

Более детальный количественный анализ состава КМ показал статистически значимые отличия в уровнях колонизации ЖКТ для некоторых видов функционально значимых микроорганизмов — продуцентов ферментов и короткоцепочечных жирных кислот (см. табл. 2). При СПКЯ это проявлялось в снижении колонизационных показателей бактерий, представляющих часть КМ, в том числе микроорганизмов, играющих важную роль в поддержании клеточного гомеостаза макроорганизма или в реализации механизмов воспаления.

При сравнении уровня колонизации ЖКТ облигатными анаэробами обнаружено, что среди 15 видов семейства Bacteroidaceae в группе пациенток с СПКЯ отмечено статистически значимое снижение количественных показателей для таких видов, как Bacteroides vulgatus (p = 0,029), Bacteroides eggerthii (p = 0,001), Bacteroides caccae (p = 0,006). Выявлено снижение количества E. coli (p < 0,001) в отличие от группы сравнения. Кроме того, на фоне общего снижения количества бактерий семейства Lactobacillaceae отмечалось значительное снижение титров двух видов — L. gasseri (р = 0,01) и L. rhamnosus (р = 0,043). Напротив, статистически значимо более высокая степень обсемененности ЖКТ отмечена для Erysipelatoclostridium ramosum (E. ramosum) (p = 0,004) и Staphylococcus aureus (p = 0,034).

В рамках данного исследования проведена оценка показателей провоспалительных маркеров в сыворотке крови. Уровни IL-6, TNF-α и СРБ у пациенток с СПКЯ (соответственно 1,2 (0,8; 2,0); 0,7 (0,2; 1,2); 4,8 (3,2; 5,8)) были значительно выше, чем в группе сравнения (соответственно 0,5 (0,2; 0,8); 0,2 (0,1; 0,6); 3,7 (3,1; 4,1)), р < 0,05. Уровни IL-1 при СПКЯ (0,6 (0,6; 0,8)) не отличались от группы сравнения (0,6 (0,6; 0,7)), p > 0,05.

 

Рис. 7. Результаты корреляционного анализа количественного состава кишечной микробиоты и маркеров хронического воспаления

Примечание. Указан коэффициент корреляции, *p < 0,05.

 

По результатам корреляционного анализа выявлена отрицательная корреляция бактерий родов Lactobacillus (r = –0,3; p = 0,026), Bifidobacterium (r = –0,4; p = 0,001), Bacteroides (r = –0,3; p = 0,006) с IL-6; вида E. coli — c IL-6 (r = –0,3; p = 0,013) и СРБ (r = –0,3; p = 0,045). Положительная корреляция наблюдалась между уровнем IL-6 и титром бактерий вида E. ramosum (r = 0,3; p = 0,023) (рис. 7).

Обсуждение

Кишечная микробиота является одним из важнейших регуляторов гомеостаза как кишечника, так и всего организма человека. Изменение состава КМ наблюдается и при воспалительных заболеваниях кишечника (язвенный колит, синдром раздраженного кишечника), и при метаболических нарушениях (ожирение и СД2). Синдром поликистозных яичников относится к числу заболеваний, которые проявляются метаболической дисфункцией, ассоциированной с повышенными рисками сердечно-сосудистых заболеваний и СД2. Литературные данные, касающиеся состава КМ при СПКЯ, немногочисленны и противоречивы. Наиболее часто можно встретить данные о снижении альфа-разнообразия КМ при ожирении и СПКЯ [15). Полученные нами результаты, указывающие на статистически значимое снижение индекса Маргалефа при СПКЯ, свидетельствуют о снижении видового богатства КМ. Уменьшение оценочного индекса видового богатства микробного сообщества может быть связано с различными заболеваниями и свидетельствует о нарушении динамического равновесия в КМ, ассоциированного не только с сокращением численности видов, но и увеличением плотности популяции одного или нескольких видов микроорганизмов в ущерб другим видам.

Известно, что качественные и количественные изменения состава КМ могут приводить к метаболическим нарушениям — ожирению и инсулинорезистентности, предположительно за счет регуляции всасывания жиров и углеводов в толстом кишечнике [16]. Роль конкретных микроорганизмов в этих процессах широко дискутируется [17]. Так, некоторые данные свидетельствуют об увеличении соотношения бактерий типов Firmicutes/ Bacteroidetes у мышей с ожирением по сравнению с худыми мышами, однако эти результаты не нашли однозначного подтверждения в исследованиях на людях [18].

В исследовании на мышиной модели СПКЯ, индуцированного летрозолом, обнаружено снижение численности родов Bacteroides [10], Lactobacillus и Christensenella [19] и более высокая — большинства видов порядка Firmicutes, включая семейства Lachnospiraceae, Erysipelotrichaceae, Ruminococcaceae [10], B. vulgatus [20] и Coprobacillus spp. [19].

В нашей работе установлено, что в отличие от группы сравнения при СПКЯ частота встречаемости гамма-Proteobacteria (Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella), стрептококков, энтерококков, стафилококков, клостридий (тип Firmicutes), а также микроскопических грибов была выше. Напротив, у здоровых женщин наблюдалась большая частота выделения бифидобактерий (тип Actinobacteria), лактобацилл (тип Firmicutes), кишечной палочки (гамма-Proteobacteria), бактероидов (тип Bacteroidetes) и прочих облигатных анаэробов. Аналогичные данные получены М.В. Яковлевой и соавторами, которые показали, что наличие метаболического синдрома усугубляет развитие дисбиотических нарушений КМ, в том числе связанных с увеличением частоты встречаемости факультативно-анаэробных УПМ, таких как Klebsiella spp., Proteus spp., Bacillus spp., Streptococcus spp., S. аureus, Neisseria spp., на фоне снижения частоты встречаемости Lactobacillus spp., Bacteroides spp. и отсутствия Bifidobacterium spp. [21].

Известно, что представители рода Bacteroides составляют значительную часть КМ с доминированием в толстом отделе ЖКТ [22]. Виды Bacteroides играют ключевую роль в поддержании цепочки пищевых взаимодействий микроорганизмов [23] и являются основными продуцентами короткоцепочечных жирных кислот в кишечнике человека, в основном ацетата, пропионата и бутирата, обеспечивающих стабильность иммунной системы и гомеостаз кишечника [24].

В нашем исследовании показано, что у пациенток с СПКЯ на фоне тенденции к снижению частоты выделения представителей семейства Bacteroidaceae отмечено статистически значимое снижение количественных показателей в КМ для таких видов, как B. vulgatus, B. eggerthii, B. caccae, по сравнению с КМ здоровых женщин. Учитывая, что одной из основных функций бактероидов является поддержание пищевых взаимодействий микроорганизмов, можно полагать, что снижение их популяции может влиять на уровень колонизации ЖКТ другими функционально значимыми микроорганизмами, продуцентами короткоцепочечных жирных кислот, из группы труднокультивируемых микроорганизмов (Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii и др.), которых мы не выделили в ходе нашего исследования. Hyun Ju You et al. показали, что численность этих микроорганизмов, ассоциирующихся со здоровым кишечником, можно увеличивать путем использования потенциальных возможностей B. vulgatus в качестве эндогенного модулятора в кишечнике. B. vulgatus SNUG 40005 снижал прибавку в весе и проницаемость кишечника у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров. Авторы считают, что B. vulgatus может быть многообещающим терапевтическим кандидатом в пробиотики при метаболических заболеваниях [25].

Выявленное в нашем исследовании снижение уровня колонизации ЖКТ E. coli у пациенток с СПКЯ свидетельствует о снижении продукции полезных ферментов и витаминов. В то же время выявленная большая частота обнаружения условно-патогенных гамма-протеобактерий семейства Enterobacteriaceae и бета-протеобактерий, относящихся к порядку Burkholderiales, а также большая их популяция в сочетании с нарушением проницаемости клеточной стенки ЖКТ могут приводить к повышенной продукции эндотоксина — липополисахарида (ЛПС). Принято считать, что у людей со здоровым кишечным эпителием ЛПС не проходит через кишечный барьер и максимальная концентрация ЛПС наблюдается в просвете кишечника, практически не проникая в кровоток [26]. Однако так называемая метаболическая эндотоксемия коррелирует с повышенной проницаемостью кишечника, на которую влияет нарушение состава КМ [27]. Липополисахарид, попадая в кровоток, взаимодействует с ЛПС-связывающим белком и мембраносвязанным рецептором CD14. Их комплекс взаимодействует с TLR4, влияя как на воспалительные сигнальные пути, так и на инсулиновые сигнальные пути [28, 29], что, в свою очередь, индуцирует NF-

B-опосредованное воспаление, связанное с развитием инсулинорезистентности.

В исследовании R.L. Young et al. показано, что ожирение характеризуется повышенной продукцией серотонина (5-гидрокситриптамин, 5-НТ), синтезируемого в кишечнике энтерохромаффинными клетками из проксимального отдела тонкой кишки, что ассоциировано с метаболической дисфункцией [30]. Выделенный из кишечника 5-НТ, вероятно, является важным фактором патогенеза ожирения и инсулинорезистентности.

У пациенток с СПКЯ, по нашим данным, статистически значимо выше, чем у здоровых женщин, оказался уровень колонизации ЖКТ E. ramosum (Clostridium ramosum). A.D. Mandiс et al. в экспериментах на мышах установили, что E. ramosum увеличивает синтез 5-НТ в кишечнике. Повышенный уровень 5-HT регулирует экспрессию основных белков, участвующих в абсорбции жирных кислот в кишечнике in vitro, что позволяет предположить, что присутствие E. ramosum может способствовать абсорбции липидов в кишечнике и развитию ожирения [31].

В нашем наблюдении у пациенток с СПКЯ на фоне общего снижения численности бактерий семейства Lactobacillaceae отмечено статистически значимое уменьшение количественных показателей для двух видов — L. gasseri и L. rhamnosus. Одним из ключевых факторов развития инсулинорезистентности при СД2 является активация серинового фосфорилирования инсулинового рецептора под действием избытка жирных кислот, что приводит к нарушению функционирования специфических белков — переносчиков глюкозы в клетку (GLUT-4). В литературе имеются сообщения, что L. gasseri увеличивает экспрессию GLUT-4, а Bifidobacterium lactis улучшает транслокацию GLUT-4 в клетках и стимулирует инсулинопосредованное поглощение глюкозы тканями. Более того, Bacteroides acidifaciens, L. gasseri, L. casei, A. muciniphila увеличивают окисление жирных кислот, что приводит, с одной стороны, к снижению фосфорилирования инсулинового рецептора и увеличению его активности, а с другой — к снижению риска ожирения. Однако авторы отмечают, что количество данных бактерий у пациентов с СД2 по мере прогрессирования заболевания значительно снижается [32].

В исследованиях ряда авторов показано, что введение лактобацилл вида L. rhamnosus мышам с ожирением способствовало снижению массы тела, уровня глюкозы в крови, уменьшению признаков воспаления и выраженности эндотоксемии [33, 34].

Таким образом, полученные нами данные, касающиеся снижения уровня колонизации ЖКТ лактобациллами и возможного участия отдельных видов при метаболических нарушениях, ассоциированных с СПКЯ, согласуются с исследованиями других авторов.

В настоящее время ведется поиск альтернативных подходов к терапии ожирения, СД2, СПКЯ, в том числе с использованием пробиотических препаратов. В многочисленных клинических исследованиях достоверно показано, что Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus снижают уровень холестерина, глюкозы крови, артериального давления [35, 36]. Постоянно проводится поиск симбиотических видов микроорганизмов, перспективных для создания лекарственных средств на основе композиций штаммов — кандидатов в пробиотические препараты с целью профилактики и лечения этих заболеваний.

Известно, что хроническое субклиническое воспаление, связанное с ожирением, ухудшает чувствительность к инсулину за счет активации N-концевой киназы c-Jun и сигнальных путей ядерного фактора каппа B, что впоследствии увеличивает высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-альфа и IL-6 [37]. Косвенным доказательством взаимосвязи полученных в нашем исследовании нарушений состава КМ с СПКЯ являются результаты корреляционного анализа между уровнем колонизации ЖКТ группами микроорганизмов, по которым получена статистически значимая разница в сравнении с здоровыми женщинами, и маркерами хронического воспаления, наблюдаемого при СПКЯ.

Однако СПКЯ является полигенным эндокринным расстройством, что подтверждается распространенностью метаболических нарушений при данной патологии. Наличие хронического субклинического воспаления у пациенток с СПКЯ может быть связанно не только с нарушением липидного обмена, но также с уровнем циркулирующих андрогенов (гиперандрогения), с инсулинрезистентностью и некоторыми другими факторами. Это, безусловно, осложняет возможность оценки взаимосвязи КМ с хроническим субклиническим воспалением при СПКЯ. В нашем исследовании мы не ставили целью получить дифференцированный ответ о роли каждого фенотипического признака СПКЯ в развитии хронического субклинического воспаления и связью с КМ, также целью настоящего исследования не было выявление изменений и корреляций, специфичных для данной патологии. Наша работа предполагала получение данных о составе КМ и его связи с маркерами хронического воспаления в общей когорте женщин с верифицированным диагнозом СПКЯ и здоровых женщин, что поможет выявить различия в группах сравнения, которые могут быть более детально изучены в последующих исследованиях с другим дизайном и использованием дополнительной группы сравнения — без СПКЯ, но с очагом потенциального хронического воспаления.

Ограничения исследования

В представленном нами материале не проводилось деление пациентов на подгруппы в зависимости от фенотипов СПКЯ, имеющих тесную связь с гормональным фоном, что не позволило нам проследить специфические линейные корреляции между КМ и уровнем сывороточных гормонов. Данное исследование было направлено на изучение изменений КМ в общей когорте женщин с верифицированным диагнозом СПКЯ по сравнению со здоровыми женщинами, наличия у них хронического субклинического воспаления и корреляции маркеров воспаления с КМ. Однако, учитывая, что СПКЯ — полигенное эндокринное расстройство, ввиду особенностей дизайна исследования не представляется возможным оценить специфичность выявленных изменений, что дает основание для проведения дальнейших исследований в данной области.

Заключение

Таким образом, КМ пациенток с СПКЯ характеризуется снижением видового богатства, о чем свидетельствует снижение индекса Маргалефа. В видовом составе КМ при СПКЯ отмечается нарушение баланса микробных сообществ, выражающееся в снижении колонизационных показателей комменсальной составляющей просветной КМ, играющей важную роль в поддержании клеточного гомеостаза макроорганизма, и повышении частоты обнаружения и генерации УПМ, ассоциированном с хроническим субклиническим воспалением.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках научно-исследовательской работы «Разработка комплексного подхода к диагностике гормонально-ассоциированных заболеваний и нарушений функционального состояния эндометрия на основе изучения микробиоты», 122020900123-4.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. Е.Д. Кириллова — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста; В.В. Муравьева — сбор и обработка материала, написание текста; Е.Л. Исаева — сбор и обработка материала; А.В. Скоробогатый — сбор и обработка материала; К.Н. Жигалова — сбор и обработка материала; А.А. Козлова — сбор и обработка материала, написание текста; Т.В. Припутневич — концепция и дизайн исследования, редактирование; Г.Е. Чернуха — концепция и дизайн исследования, написание текста, редактирование. Все авторы прочли и одобрили окончательную версию рукописи перед публикацией.

About the authors

Ekaterina D. Kirillova

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Author for correspondence.
Email: emiroshina.md@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3723-5052

Junior Research Assistant

Россия, 4 Oparina Academician str., 117997, Moscow

Vera V. Muravieva

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: ammur14@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0383-0731
SPIN-code: 5831-3030

PhD in Biology, Senior Researcher

Россия, 4 Oparina Academician str., 117997, Moscow

Elena L. Isaeva

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: e_isaeva@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0001-6224-8202

MD, PhD, Senior Researcher]

Россия, 4 Oparina Academician str., 117997, Moscow

Aleksey V. Skorobogatiy

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: a_skorobogatiy@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0003-2137-6421

Junior Research Assistant

Россия, 4 Oparina Academician str., 117997, Moscow

Ksenya N. Zhigalova

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: k_zhigalova@oparina4.ru
ORCID iD: 0000-0001-6949-5759
SPIN-code: 3899-2245

Junior Research Assistant]

Россия, 4 Oparina Academician str., 117997, Moscow

Anastasia A. Kozlova

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: aakozlova.box@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9911-5929

PhD, Student

Россия, 4 Oparina Academician str., 117997, Moscow

Tatiana V. Priputnevich

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: priput1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4126-9730
SPIN-code: 8383-7023

MD, PhD, Corresponding Member of the RAS

Россия, 4 Oparina Academician str., 117997, Moscow

Galina E. Chernukha

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: c-galina1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9065-5689
SPIN-code: 5514-3483

MD, PhD, Professor

4 Oparina Academician str., 117997, Moscow

References

Supplementary files