Drug-Resistant Tuberculosis: Development Mechanisms and Methods of Molecular Genetic Diagnosis

Full Text

Введение

Проблема устойчивости патогенных микроорганизмов к противомикробным препаратам входит в десятку основных стоящих перед человечеством глобальных угроз здоровью населения и представляет собой серьезную общемировую угрозу, имеющую далеко идущие последствия для здравоохранения и экономики [1, 2]. Возбудитель туберкулеза не стал исключением: по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), во всем мире после некоторой стабилизации в период 2015–2020 гг. в 2021 г. отмечается нарастание туберкулеза с лекарственной устойчивостью возбудителя (450 тыс. новых случаев в 2021 г. по сравнению с 437 тыс. в 2020-м, рост на 3,1%) [3].

В зависимости от спектра препаратов, к которым устойчив возбудитель, выделяют несколько значимых вариантов лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis — это множественная (МЛУ), предширокая (пре-ШЛУ) и широкая (ШЛУ) лекарственная устойчивость. МЛУ характеризуется устойчивостью M. tuberculosis одновременно к двум наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам — рифампицину и изониазиду независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам. При пре-ШЛУ к этой комбинации препаратов добавляется устойчивость к препаратам фторхинолонового ряда и при ШЛУ к предыдущему варианту устойчивости добавляется устойчивость к новым противотуберкулезным препаратам — линезолиду или бедаквилину [4, 5].

Россия относится к странам с высоким бременем туберкулеза с МЛУ возбудителя (МЛУ-ТБ) (показатель включает также пре-ШЛУ и ШЛУ). Несмотря на то что распространенность МЛУ-ТБ в стране в последние годы начала снижаться (с 20,6 на 100 тыс. населения в 2020 г. до 18,1 на 100 тыс. населения в 2021 г.), этот показатель по-прежнему остается высоким [3, 6]. Успешный исход терапии МЛУ-ТБ, по данным ВОЗ, составляет около 60%. Еще сложнее поддаются лечению пре-ШЛУ-ТБ и особенно ШЛУ-ТБ, возбудитель при котором устойчив, в том числе к современным эффективным противотуберкулезным препаратам [3, 7].

Таким образом, расширение спектра лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза, особенно за счет противотуберкулезных препаратов последнего поколения, представляет собой крайне опасное явление, так как существенно ограничивает эффективность существующих методов лечения и ведет к ухудшению эпидемической ситуации по туберкулезу. Понимание основ эволюции лекарственной устойчивости будет способствовать разработке эффективных стратегий предотвращения амплификации резистентности. Учитывая актуальность проблемы, в статье будут рассмотрены современные представления о возникновении лекарственной устойчивости у M. tuberculosis и описаны существующие подходы для быстрого и высокоэффективного определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам как основного пути предотвращения распространения лекарственно-устойчивых M. tuberculosis.

Природа лекарственной устойчивости M. tuberculosis

M. tuberculosis обладают естественной резистентностью ко многим антибактериальным препаратам [8, 9]. Главным образом естественная резистентность M. tuberculosis обусловлена особенностью строения клеточной стенки. Клеточная стенка M. tuberculosis, в отличие от грамположительных и грамотрицательных бактерий, имеет сложный состав и представлена тремя структурами: 1) наружной мембраной, которая имеет два слоя — внешний, состоящий из липидов, и внутренний, состоящий из длинноцепочечных миколовых кислот; 2) слоем арабиногалактана, ковалентно связанного с миколовыми кислотами, и 3) слоем пептидогликана. Большое количество липидов делает оболочку клеток M. tuberculosis высокогидрофобной, а значительная толщина оболочки препятствует диффузии даже гидрофобных молекул. Периплазматическое пространство, отделяющее клеточную стенку от липидного бислоя мембраны, дополнительно защищает клетки от стрессов окружающей среды и проникновения антибиотиков. Кроме того, M. tuberculosis обладают природной устойчивостью к β-лактамным антибиотикам благодаря тому, что в геноме M. tuberculosis закодированы по крайней мере четыре β-лактамазы (blaC, blaS, Rv0406c и Rv3677c), которые гидролизуют β-лактамное кольцо и инактивируют препараты [8, 10].

Несмотря на такую мощную защиту микобактерий от проникновения извне различных субстанций, которые могут причинить потенциальный вред, препараты, эффективные против M. tuberculosis, существуют. Их принято разделять на препараты первой и второй линий: препараты первой линии, или основные, которые применяют для лечения туберкулеза, вызванного лекарственно-чувствительными микобактериями, и препараты второй линии, или резервные, которые применяют для лечения туберкулеза с МЛУ, пре-ШЛУ и ШЛУ возбудителя [4]. ВОЗ дополнительно разделяет препараты второй линии на три группы (от А до С) в зависимости от приоритетности включения в схему терапии туберкулеза с лекарственной устойчивостью возбудителя (табл. 1) [11]. Противотуберкулезные препараты воздействуют на структурные компоненты клетки и клеточные процессы, в результате оказывая бактерицидное или бактериостатическое действие на M. tuberculosis. Так, изониазид, этионамид/ протионамид, этамбутол, D-циклосерин, деламанид/претоманид подавляют биосинтез клеточной стенки, рифампицин ингибирует синтез РНК, фторхинолоны — синтез ДНК, стрептомицин, канамицин/амикацин, капреомицин, линезолид — синтез белка, бедаквилин — синтез АТФ, пиразинамид истощает мембранный потенциал клетки и т.д. [12, 13].

 

Таблица 1. Механизм действия препаратов и гены, ассоциированные с устойчивостью M. tuberculosis [12, 13, 18, 23, 28, 31]

Группа препаратов по классификации ВОЗ [7]	Препарат	Механизм действия препарата	Структуры, связанные с устойчивостью
			Ген	Продукт
Препараты первого ряда
—	Изониазид	Ингибиция синтеза клеточной стенки (подавление синтеза миколовых кислот)	katG	Каталаза/пероксидаза3
			inhA	NADH-зависимая еноил-ACP редуктаза
	Рифампицин	Ингибиция синтеза РНК	rpoB	β-субъединица РНК-полимеразы
	Пиразинамид2	Закисление цитоплазмы и истощение мембранного потенциала	pncA	Пиразинамидаза3
			rpsA	Рибосомальный белок S1
			panD	Аспартатдекарбоксилаза
			clpC1	Протеаза
	Этамбутол2	Ингибиция синтеза клеточной стенки (подавление синтеза арабиногалактана)	embB	Арабинозилтрансфераза
	Стрептомицин2	Ингибиция синтеза белка (блокирует малую субъединицу рибосомы)	rpsL	Белок S12
			rrs	16S рРНК
			gidB	Предполагаемая 16S рРНК-метилтрансфераза
Препараты второго ряда
А	Фторхинолоны	Ингибиция синтеза ДНК	gyrA	α-субъединица ДНК-гиразы
			gyrB	β-субъединица ДНК-гиразы
	Бедаквилин	Ингибиция синтеза АТФ	atpE	АТФ-синтаза
	Линезолид	Ингибиция синтеза белка (блокирует большую субъединицу рибосомы)	rplC	Рибосомальный белок L3
			rrl	23S рРНК
B	Циклосерин	Ингибиция синтеза клеточной стенки (подавление синтеза пептидогликана)	ald	L‐аланиндегидрогеназа
			alr	D-аланинрацемаза
С1	Деламанид	Ингибиция синтеза клеточной стенки (подавление синтеза миколовых кислот)	ddn	Деазафлавин-зависимая нитроредуктаза3
			fgd1	Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
			fbiA	Белок FbiA для биосинтеза кофактора флавина F420
			fbiB	Белок FbiB для биосинтеза кофактора флавина F420
			fbiC	Белок FbiC для биосинтеза кофактора флавина F420
	Амикацин	Ингибиция синтеза белка (блокирует малую субъединицу рибосомы)	rrs	16S рРНК
	Этионамид/протионамид	Ингибиция синтеза клеточной стенки (подавление синтеза миколовых кислот)	inhA	NADH-зависимая еноил-ACP редуктаза
			ethA	Монооксигеназа3
	Пара-аминосалициловая кислота	Ингибиция синтеза фолиевой кислоты	folC	Дигидрофолатсинтаза
			dfrA	Дигидрофолатредуктаза
			thyA	Тимидилатсинтаза A
—4	Канамицин	Ингибиция синтеза белка (блокирует малую субъединицу рибосомы)	rrs	16S рРНК
	Капреомицин	Ингибиция синтеза белка (блокирует малую субъединицу рибосомы)	rrs	16S рРНК

¹ Прочие препараты, которые могут быть использованы в случае, если режим не может быть составлен из препаратов групп A и B.

² При лечении МЛУ-, пре-ШЛУ- и ШЛУ-туберкулеза входит в группу С.

³ Трансформирует пролекарство в активную форму препарата.

⁴ Не являются препаратами, рекомендованными ВОЗ для лечения туберкулеза.

 

В процессе адаптации к условиям химиотерапии у M. tuberculosis выработались механизмы, позволяющие защититься от действия противотуберкулезных препаратов. Ряд таких механизмов имеет неспецифический характер и связан с гиперпродукцией эффлюксных насосов, модификацией лекарств или с мимикрией мишени [12, 13].

Эффлюксные насосы представляют собой мембранные белки, которые осуществляют активный транспорт питательных веществ, токсинов, отходов или сигнальных молекул через клеточную оболочку. Также эффлюксные насосы могут вытеснять молекулы лекарств, попадающих в бактериальные клетки. Повышение количества эффлюксных насосов в клетке M. tuberculosis, которое происходит вследствие сверхэкспрессии соответствующих генов, способно снизить концентрацию противотуберкулезных препаратов в клетке вплоть до нетоксичной для M. tuberculosis [8, 17]. Всего у M. tuberculosis существует пять суперсемейств эффлюксных насосов, каждое из которых включает 10–20 белков-переносчиков, но значение для развития устойчивости к противотуберкулезным препаратам установлено пока лишь для некоторых из них. Например, было показано, что в ответ на лечение фторхинолонами повышается уровень экспрессии насоса PstB, кодируемого Rv0933c, что позволяет предположить связь гиперэкспрессии PstB с устойчивостью к фторхинолонам [14, 18]. Также отмечена повышенная экспрессия ряда генов, кодирующих эффлюксные насосы, в ответ на терапию изониазидом и рифампицином (jefA, drrA, drrB, efpA, mmr, Rv1217-Rv1218, Rv1258c (Tap)) и стрептомицином (whiB7 и Rv1258c (Tap)) [15, 16, 19, 20]. Также доказано, что гиперпродукция насоса JefA приводит к устойчивости к изониазиду, стрептомицину и этамбутолу, насоса Tap — к фторхинолонам и канамицину, насоса P55 (Rv1410c) — к стрептомицину, насоса IniBAC — к изониазиду и этамбутолу, насоса EfpA — к изониазиду и рифампицину, насоса MmpL17 — к изониазиду [14, 15, 18, 19]. Считается, что эффлюксные насосы являются хорошей мишенью для разработки новых противотуберкулезных препаратов — ингибиторов оттока [21, 22].

Еще один механизм неспецифической адаптации M. tuberculosis к противотуберкулезной терапии основан на том, что активность антибактериальных препаратов может утрачиваться из-за химических модификаций, таких как метилирование и ацетилирование, которые предотвращают связывание препарата с белком-мишенью [8, 17, 23]. Лучше всего изучен механизм инактивации аминогликозидов / циклических пептидов ацетилтрансферазой Eis (enhanced intracellular survival — белок повышения внутриклеточного выживания). Такое название этот белок получил из-за того, что препятствует первичному ответу макрофага в ответ на проникновение в него M. tuberculosis, следовательно, защищает микобактерии от иммунитета хозяина и помогает выжить патогену в макрофагах. В дополнение к этому Eis способен ацетилировать и инактивировать канамицин (но не амикацин) и капреомицин. Избыточная экспрессия гена eis, которая может возникать вследствие мутаций в его промоторе, приводит к устойчивости к канамицину и, вероятно, капреомицину [20, 24].

Интересным механизмом адаптации M. tuberculosis в ответ на антибактериальную терапию является мимикрия мишени, т.е. имитация возбудителем молекулы — мишени препарата. Эта уникальная стратегия применяется M. tuberculosis для нейтрализации действия фторхинолонов. Мишенью фторхинолонов в клетке M. tuberculosis является ДНК-гираза в комплексе с ДНК. Белок MfpA (Mycobacterium fluoroquinolone resistance protein A — микобактериальный белок устойчивости к фторхинолонам) по форме и размеру похож на ДНК M. tuberculosis. Это сходство приводит к тому, что ДНК-гираза связывается с MfpA, и этот комплекс становится мишенью для фторхинолонов: молекулы препарата растрачиваются на ложную мишень, и синтез ДНК в клетке продолжается [25, 26].

Описанные выше неспецифические механизмы могут быть непосредственной причиной развития лекарственной устойчивости за счет полной нейтрализации того или иного препарата или, что гораздо чаще, снижать концентрацию препарата в клетке до субингибиторной концентрации, что будет способствовать формированию и отбору клонов M. tuberculosis с генетически закрепленной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам, возникающей за счет спонтанных мутаций в генах, которые кодируют мишени препарата или ферменты, активирующие лекарственные средства [27–29].

Мутации в геноме M. tuberculosis являются высокоспецифическим механизмом формирования устойчивости к тому или иному противотуберкулезному препарату и рассматриваются как основной путь возникновения резистентности. Причем в отличие от других бактерий, которые могут приобретать лекарственную устойчивость в результате горизонтального переноса генов, опосредованного плазмидами, транспозонами или фагами, устойчивость M. tuberculosis обусловлена мутациями исключительно в хромосомных генах [12, 13, 30]. Однонуклеотидные полиморфизмы, вставки и делеции в целевых генах приводят к неспособности метаболизировать пролекарства до активных форм или к модификации структуры мишени лекарственного средства, в результате чего происходит снижение эффективности связывания с препаратом (см. табл. 1).

Появление устойчивых к лекарствам мутантных клонов во многом обусловлено концентрацией лекарственного средства в месте нахождения возбудителя: при концентрации препарата ниже терапевтической M. tuberculosis сохраняют способность к делению и, следовательно, возникновению спонтанных мутаций. В результате мутантные клоны получают адаптивное преимущество и сохраняются в организме хозяина [12, 32, 33]. Такая ситуация может возникнуть из-за неправильно назначенной химиотерапии, слабой приверженности пациента к лечению, низкого качества препаратов, а также из-за особенностей метаболизма пациента и его нутритивного статуса. В процессе эволюции мутации в геноме могут накапливаться, приводя к появлению множественной и далее широкой лекарственной устойчивости, вплоть до тотальной [8, 14, 34].

Первый случай лекарственной устойчивости у микобактерий (устойчивость к стрептомицину) был зафиксирован вскоре после начала применения этого препарата для лечения туберкулеза [35]. Исследования с использованием полногеномного секвенирования позволили проследить дальнейшее прогрессирование лекарственной устойчивости M. tuberculosis: сначала возникла комбинированная устойчивость к стрептомицину и изониазиду, затем присоединилась устойчивость к рифампицину и этамбутолу, далее — к пиразинамиду и наконец — к препаратам второго ряда [36–39].

Частота возникновения спонтанных мутаций составляет 10^–6–10^–8. Так как спонтанные мутации, приводящие к лекарственной устойчивости, возникают независимо друг от друга, то вероятность возникновения устойчивости одновременно к трем препаратам составляет лишь 10^–18–10^–20. Следовательно, если режим химиотерапии включает комбинацию из трех и более эффективных препаратов, то теоретически вероятность формирования лекарственно-устойчивого клона отсутствует, так как каждый вновь возникающий мутант, приобретший устойчивость к одному препарату, будет уничтожаться двумя другими препаратами. Поэтому фундаментальным принципом терапии туберкулеза является полихимиотерапия [4, 40].

Для предотвращения появления лекарственной устойчивости адекватная химиотерапия должна быть начата в максимально ранние сроки. Однако из-за того, что M. tuberculosis — медленнорастущий микроорганизм, выделение культуры из диагностического материала для проведения тестов лекарственной чувствительности занимает не менее 2–3 нед и может доходить до 3 мес [4, 41]. Затем проводится культуральное определение лекарственной чувствительности, которое занимает еще 2–3 нед. Следовательно, важно развивать методы, позволяющие быстро определять чувствительность M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.

Секвенирование как инструмент диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза

Исходя из того, что основным специфическим механизмом приобретенной лекарственной устойчивости у M. tuberculosis являются мутации в определенных генах, очевидно, что выявление этих мутаций — идеальный инструмент для диагностики. «Золотой стандарт» определения структуры генов — метод секвенирования. Появление технологий секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS) существенно упростило и ускорило процедуру анализа геномов и имеет большой потенциал для использования в качестве метода для быстрого определения лекарственной устойчивости M. tuberculosis [42].

Наиболее полную характеристику возбудителя предоставляет полногеномное секвенирование, которое позволяет получить не только информацию о наличии или отсутствии мутаций в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к тому или иному препарату, но и данные для молекулярной эпидемиологии, эволюции и филогении M. tuberculosis [43–47].

Для получения достоверных результатов полногеномного секвенирования подходит только чистая культура M. tuberculosis, поскольку при прямом тестировании клинических образцов картина может быть искажена вследствие примеси ДНК человека и комменсальных микроорганизмов. Следовательно, время получения результатов генотипической лекарственной устойчивости будет определяться сроками получения культуры M. tuberculosis из диагностического материала, которые, как описано выше, могут составлять несколько месяцев, поэтому на данном этапе развития технологии полногеномное секвенирование нельзя отнести к ускоренным методам определения лекарственной устойчивости M. tuberculosis.

Поскольку устойчивость к противотуберкулезным препаратам у M. tuberculosis обусловлена мутациями в известных генах, для определения лекарственной устойчивости можно применять таргетное секвенирование, при котором анализируется нуклеотидная последовательность не всего генома, а только интересующих генных мишеней. Эта технология позволяет работать с ДНК, выделенной непосредственно из образцов клинического материала, и получить данные о мутациях в целевых генах в течение нескольких суток [47].

ВОЗ рекомендует этот метод для определения генотипической лекарственной чувствительности с 2018 г. [48]. В настоящее время на рынке представлены два коммерческих набора для секвенирования генов M. tuberculosis, вовлеченных в лекарственную устойчивость. Во-первых, это набор Next Gen-RDST (Исследовательский институт трансляционной геномики, США), который выявляет мутации в 6 генах, связанных с устойчивостью к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, аминогликозидам и циклическим пептидам [49]. Во-вторых, более функцио-нальный набор Deeplex®-MycTB (GenoScreen, Лилль, Франция), позволяющий определять мутации в 18 генах, ассоциированных с устойчивостью к 12 противотуберкулезным препаратам (рифампицину, изониазиду, этионамиду, пиразинамиду, этамбутолу, стрептомицину, амикацину, канамицину, капреомицину, фторхинолонам, линезолиду, бедаквилину). Дополнительно по анализу последовательности генов hsp65, rrs, rplC, rrl этот тест позволяет определить вид микобактерий, входящих в туберкулезный комплекс (МБТК), или нетуберкулезных микобактерий (НТМБ), получить сполиготип M. tuberculosis и, суммировав всю полученную информацию, провести филогенетический анализ [50, 51].

В 2021 г. ВОЗ с целью улучшения интерпретации результатов секвенирования издала каталог мутаций микобактерий туберкулезного комплекса, который позволил упорядочить знания о роли генетических полиморфизмов в формировании лекарственно-устойчивого фенотипа. Каталог содержит информацию о мутациях в генах, ассоциированных с устойчивостью ко всем противотуберкулезным препаратам первого ряда, а также к препаратам второго ряда: фторхинолонам, бедаквилину, линезолиду, деламаниду, амикацину, этионамиду, которые были получены при анализе почти 40 тыс. изолятов M. tuberculosis [52].

На основании сопоставления данных секвенирования с результатами теста фенотипической лекарственной чувствительности мутации были классифицированы на пять категорий: связанная с устойчивостью, не связанная с устойчивостью и три промежуточных варианта [52]. Набор мутаций первой категории (связанные с устойчивостью) представляет наибольший интерес при интерпретации результатов определения мутаций в целевых генах. В эту категорию вошли мутации, которые были выявлены у пяти и более изолятов M. tuberculosis вне зависимости от их фенотипической чувствительности к соответствующему препарату, нижняя граница 95%-го ДИ величины прогностической ценности положительного результата (ППР) была не меньше 25%, отношение шансов (ОШ) — > 1 со статистической значимостью, рассчитанной по критерию Фишера, p ≤ 0,05. Число мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, и суммарная оценка диагностических характеристик метода таргетного секвенирования с использованием набора мутаций первой категории представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Диагностические характеристики метода таргетного секвенирования с использованием набора мутаций, определенных как «связанные с лекарственной устойчивостью», согласно каталогу ВОЗ [52]

Препарат	Исследовано штаммов	Число мутаций		Основные диагностические характеристики, %
		Всего	Связанных с лекарственной устойчивостью	Чувствительность	Специфичность	ППР
Рифампицин	34 282	120	24	92,3	98,3	95,6
Изониазид	34 445	36	5	90,0	98,5	97,1
Этамбутол	30 708	59	14	86,3	93,3	71,1
Пиразинамид	15 902	233	105	56,8	99,1	91,9
Левофлоксацин	18 277	30	8	83,1	98,7	93,0
Бедаквилин	88	4	—	—	—	—
Линезолид	10 942	3	1	38,2	99,8	73,4
Деламанид	7778	1	—	—	—	—
Амикацин	16 978	28	2	76,4	99,1	87,4
Стрептомицин	13 984	33	12	75,2	98,0	94,8
Этионамид	13 918	27	4	47,2	95,8	75,2

Примечание. Диагностическая чувствительность метода — процент штаммов M. tuberculosis с одной из мутаций, входящих в число связанных с лекарственной устойчивостью по данным каталога ВОЗ, из числа штаммов M. tuberculosis с фенотипической устойчивостью к соответствующему препарату. Диагностическая специфичность метода — процент штаммов M. tuberculosis, не имеющих мутаций, входящих в число связанных с лекарственной устойчивостью по данным каталога ВОЗ, из числа штаммов M. tuberculosis с фенотипической чувствительностью к соответствующему препарату. Прогностическая ценность положительного результата (ППР) — процент фенотипически устойчивых штаммов из числа штаммов M. tuberculosis, имеющих одну из мутаций, входящих в число связанных с лекарственной устойчивостью по данным каталога ВОЗ.

 

Как видно из данных табл. 2, при отсутствии в геноме M. tuberculosis какой-либо из мутаций, классифицированных как ассоциированные с лекарственной устойчивостью, штамм в 93,3–99,8% случаев будет фенотипически чувствительным к соответствующему препарату, т.е. метод таргетного секвенирования имеет высокую диагностическую специфичность при определении устойчивости ко всем традиционно используемым противотуберкулезным препаратам. В то же время диагностическая чувствительность метода, т.е. доля устойчивых штаммов, имеющих в геноме одну из мутаций первой категории, из всех фенотипически устойчивых штаммов, был достаточно высоким для рифампицина (92,3%) и изониазида (90,0%). Чувствительность таргетного секвенирования при определении устойчивости к остальным препаратам колебалась от 38,2 до 86,3%.

Еще один, возможно, наиболее важный с точки зрения определения генотипической лекарственной устойчивости показатель ППР оценивает, какая доля изолятов была правильно определена как фенотипически устойчивые при наличии в геноме одной из мутаций первой категории. Этот показатель был более 90% при определении устойчивости к рифампицину, изониазиду, пиразиинамиду, левофлоксацину, стрептомицину, а для этамбутола, линезолида, амикацина и этионамида был недостаточно высоким.

Диагностические характеристики метода при определении устойчивости к бедаквилину и деламаниду определены не были, так как выделено мало штаммов с мутациями в целевых генах (четыре для бедаквилина и один для деламанида) и ни одна из них не была ассоциирована с фенотипической устойчивостью к этим препаратам. Для линезолида также были описаны только три мутации, из которых лишь одна была ассоциирована с фенотипической устойчивостью, чем объясняются низкие значения показателя чувствительности и ППР метода таргетного секвенирования для определения устойчивости к этому препарату.

Следовательно, методом секвенирования можно получить высокодостоверные результаты не для всех противотуберкулезных препаратов: устойчивых к новым препаратам штаммов M. tuberculosis мало для того, чтобы сделать заключение о значимости мутаций в целевых генах, а низкие показатели диагностической чувствительности и ППР метода секвенирования при определении устойчивости к этамбутолу, амикацину и этионамиду могут быть связаны, с одной стороны, с возможно неадекватными критическими концентрациями препаратов при проведении фенотипических тестов лекарственной чувствительности, а с другой — с недостаточно изученным механизмом развития устойчивости к этим препаратам. Подобная нечеткость при интерпретации результатов таргетного секвенирования несколько снижает клиническую значимость этого теста.

Существенные ограничения для широкого внедрения этой технологии в работу диагностических лабораторий фтизиатрического профиля — высокая стоимость оборудования и реагентов, отсутствие легкодоступных решений для анализа и хранения данных, а также высокие требования к квалификации сотрудников на всех этапах проведения теста, при биоинформатической обработке и клинической интерпретации данных секвенирования.

Необходимо отметить, что при сравнении числа мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, из каталога ВОЗ с числом мутаций, полученных в результате популяционных исследований в различных мировых регионах, видно, что более 90% штаммов с резистентным генотипом несут существенно меньший набор мутаций, чем заявлен ВОЗ как связанный с лекарственной устойчивостью. Исходя из этого, можно заключить, что большинство случаев резистентности M. tuberculosis имеет в своей основе ограниченный набор мутаций. Например, в Российской Федерации более 90% штаммов, устойчивых к рифампицину, имеет семь мутаций в кодонах 435(516), 445(526) и 450(531) гена rpoB; около 95% штаммов, устойчивых к изониазиду, — мутацию katG_S315T; 99% штаммов M. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, — шесть мутаций в кодонах 90, 91 и 94 гена gyrA [53]. В других мировых популяциях штаммы с этими мутациями также доминируют среди устойчивых штаммов M. tuberculosis [52, 54].

Таким образом, можно заключить, что основным фактором резистентности является ограниченный набор мутаций, который определяется у большинства устойчивых штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в определенном регионе. Причины этого феномена и его полезность для диагностики лекарственной устойчивости будут рассмотрены в следующем разделе.

Ограниченного набора мутаций достаточно для эффективной диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза

Вследствие того что лекарственная устойчивость ассоциирована с мутациями в генах, кодирующих важные для жизнедеятельности микобактериальной клетки белки и ферменты, изменение их структуры может негативно влиять на жизнеспособность M. tuberculosis и снижать шансы лекарственно-устойчивого клона быть переданным следующему хозяину. Следовательно, конкурентное преимущество будут иметь те штаммы M. tuberculosis, фитнес которых в результате приобретения лекарственной устойчивости снижается незначительно или совсем не снижается, т.е. «цена мутаций» низкая.

Влияние мутаций на фитнес M. tuberculosis изучено недостаточно хорошо: существует ограниченное число публикаций, посвященных этому вопросу. При изучении влияния на жизнеспособность M. tuberculosis устойчивости к рифампицину была оценена скорость роста на питательной среде культур спонтанных мутантов по гену rpoB, полученных в лабораторных условиях. Было показано, что большинство мутаций существенно снижает жизнеспособность штаммов, кроме мутации rpoB_S450(531)L: скорость роста M. tuberculosis с этой мутацией была такой же, как у чувствительного предкового штамма [55–57].

Про значение мутаций, приводящих к устойчивости к изониазиду, известно мало, однако считается, что M. tuberculosis с мутациями katG_S315T и inhA_c15t сохраняют жизнеспособность и вирулентность, что доказано экспериментами в мышиной модели и в опытах in vitro [58, 59]. Также известно, что в случае мутации katG_S315T активность каталазы-пероксидазы сохраняется на уровне 30–40% от исходной, что считается достаточным для нормального функционирования клетки, но недостаточно для активации изониазида [60, 61].

«Цена мутаций», приводящих к устойчивости к аминогликозидам, была изучена на M. smegmatis. Скорость роста культуры мутантных штаммов не менялась по сравнению с чувствительным предковым штаммом, что позволило сделать вывод об отсутствии влияния этих мутаций на жизнеспособность M. smegmatis. Однако учитывая, что M. tuberculosis и M. smegmatis не являются близкородственными видами, влияние мутаций, ассоциированных с устойчивостью к аминогликозидам, на жизнеспособность M. tuberculosis может отличаться [62].

Принято считать, что в процессе адаптации в геноме лекарственно-устойчивых M. tuberculosis могут возникать мутации, которые способны компенсировать изменение структуры белка-мишени или наладить ферментативные процессы за счет повышения экспрессии генов, участвующих в сходных метаболических путях [63]. Несмотря на то что нет прямых экспериментальных доказательств о компенсирующей роли мутаций, имеются данные, свидетельствующие, что у M. tuberculosis, мутантных по тому или иному гену, ассоциированному с лекарственной устойчивостью, присутствуют мутации в других областях генома, кодирующие другие субъединицы дефектных вследствие приобретения лекарственной устойчивости белков, или сходные метаболические пути. Например, компенсаторным механизмом, связанным с устойчивостью к изониазиду, считается мутация в регуляторной области ahpC, которая приводит к сверхэкспрессии алкилгидропероксидредуктазы (AhpC), ответственной за устойчивость M. tuberculosis к реактивным производным кислорода и азота: повышение уровня этого фермента способно компенсировать потерю активности каталазы-пероксидазы [32, 57, 64].

При устойчивости к рифампицину в качестве компенсаторных называют мутации в генах rpoA и rpoC, кодирующих другие субъединицы РНК-полимеразы [32, 57, 64]. Также сообщается о внутригенной компенсаторной мутации в гене rpoB (V534(615)M), которая приводит к увеличению скорости элонгации транскрипции, которая компенсирует дефектную активность РНК-полимеразы [12]. Однако относительно мутаций, считающихся компенсаторными при устойчивости к рифампицину, следует отметить, что описанные выше механизмы компенсации были найдены у штаммов M. tuberculosis с мутацией rpoB_S450(531)L, которая сама по себе не имеет негативного влияния на фитнес M. tuberculosis, поэтому, вероятно, в обоих случаях речь скорее идет о штаммовом полиморфизме, а не о компенсации.

Исходное влияние мутации на жизнеспособность и возникновение компенсаторных мутаций играют ключевую роль при возникновении лекарственной устойчивости de novo. При изучении распространения лекарственно-устойчивых клонов ведущую роль начинают играть законы популяционной генетики, например эффект бутылочного горлышка, т.е. совокупность неких случайных факторов, поспособствовавших отбору того или иного мутантного варианта, например региональные особенности туберкулезного контроля, глобальный генетический фон штамма, обусловленный принадлежностью к филогенетической линии M. tuberculosis, циркулирующих в данной местности, и т.д., обеспечивающие уникальную структуру местной популяции лекарственно-устойчивых микобактерий [65, 66]. Так, о важности генетического фона может свидетельствовать тот факт, что фитнес штаммов с мутацией rpoB_H445(526)D двух разных филогенетических линий отличается [55].

Тем не менее исходная «цена мутации», очевидно, первична в эпидемиологии туберкулеза с лекарственной устойчивостью возбудителя: во всем мире доминирующей мутацией, обусловливающей устойчивость к рифампицину, является мутация rpoB_S450(531)L, не оказывающая негативного влияния на фитнес, а мутант rpoB_R448(529) Q, для которого в эксперименте была показан наименьший фитнес, крайне редко выделяется от больных (6 из 9849 устойчивых штаммов M. tuberculosis, 0,06% [52]), возможно, вследствие того, что компенсаторные мутации, которые позволили бы этому мутантному варианту распространиться в популяции, не успевают сформироваться, так как этот мутант вследствие своей низкой жизнеспособности довольно быстро вытесняется из циркуляции другими, более приспособленными мутантами [52, 55]. В то же время для адаптации M. tuberculosis с мутациями, которые фитнес снижают, но не критично, весьма вероятным представляется вышеописанный механизм компенсации негативных последствий лекарственной устойчивости для жизнеспособности. Подтверждением этого предположения может служить тот факт, что частота встречаемости M. tuberculosis с определенными мутациями коррелирует с полученными в эксперименте данными о влиянии этих мутаций на жизнеспособность M. tuberculosis: чем ниже «цена мутации», тем выше частота ее выявления при популяционных исследованиях [62, 55, 33].

Таким образом, можно заключить, что в распространение туберкулеза с лекарственной устойчивостью возбудителя основной вклад вносят M. tuberculosis с мутациями, оказывающими минимальное влияние на жизнеспособность, которые сочетаются с благоприятным генетическим фоном. Следовательно, число эпидемиологически значимых мутаций довольно ограничено, и для обеспечения достаточного уровня диагностики устойчивости к противотуберкулезным препаратам в большинстве случаев достаточно ПЦР-тестов, применение которых не требует значительных материальных затрат и изменения существующей инфраструктуры.

Для определения генотипической лекарственной устойчивости ВОЗ рекомендует ограниченное число тестов: Xpert MTB/RIF, MTB/RIF Ultra, MTB/XDR (Cepheid, США), Truenat MTB, MTB Plus и MTB-RIF Dx (Molbio Diagnostics, Индия), GenoType MTBDRplus, MTBDRsl (Bruker, США (ранее Hain Lifescience, Германия)), Genosholar NTM+MDRTB (Nipro, Япония)(табл. 3). Тесты Xpert и Truenat представляют собой картриджные системы, работа с которыми требует минимальной квалификации персонала, так как для проведения анализа достаточно поместить в картридж определенный объем диагностического материала и на выходе получить данные по устойчивости, которые предоставляет каждый вид теста. Тесты GenoType и Genosholar относятся к гибридизационным технологиям, являются трудоемкими и имеют высокий риск контаминации. Рекомендованных ВОЗ тестов, основанных на ПЦР в режиме реального времени, не существует [68].

В Российской Федерации из рекомендованных ВОЗ тестов применяется только Xpert MTB/RIF, однако существует много отечественных тест-систем, одобренных Росздравнадзором, позволяющих проводить высокоэффективную молекулярную диагностику туберкулеза (см. табл. 3).

 

Таблица 3. Тесты для ПЦР-диагностики туберкулеза

Процедура	Тесты, рекомендованные ВОЗ [68]	Отечественные тесты
Выделение ДНК	Truenat MTB1 Xpert MTB/RIF1, 2 Xpert MTB/RIF Ultra1, 2 Автоматизированные платформы3	АмплиСенс MTC-FL АмплиСенс МБТ-Eph Амплитуб-Преп Амплитуб-РВ МИКО-ГЕН РеалБест ДНК МВТС ТБ-Биочип-14 ТБ-БИОЧИП-24 ТБ-ТЕСТ4
Выявление МБТК и/или дифференциация видов внутри комплекса	FluoroType MTB5 Loopamp MTBC detection kit Genosholar NTM+MDRTB5 Truenat MTB и MTB Plus1 Xpert MTB/RIF1, 2 Xpert MTB/RIF Ultra1, 2 Автоматизированные платформы3	АмплиСенс MTC-FL АмплиСенс МБТ-Eph АмплиСенс MTC-diff-FL6 Амплитуб-РВ МИКО-ГЕН6) РеалБест ДНК МВТС ТБ-Биочип-14 ТБ-БИОЧИП-24 ТБ-ТЕСТ4
Дифференциация МБТК и НТМБ	Genosholar NTM+MDRTB5	МТВ-тест Амплитуб РВ+НТМБ7
Видовая идентификация НТМБ	Genosholar NTM+MDRTB5	Амплитуб-НТМБ-дифференциация7
Генотипическая устойчивость к:
• изониазиду	GenoType MTBDRplus5 Genosholar NTM+MDRTB5 Автоматизированные платформы3	АмплиТест МБТ-Резист-I Амплитуб-МЛУ-РВ MTB-RESIST-I-тест ТБ-Биочип-14 ТБ-ТЕСТ4
• рифампицину	GenoType MTBDRplus5 Genosholar NTM+MDRTB5 Truenat MTB-RIF Dx Xpert MTB/RIF1, 2 Xpert MTB/RIF Ultra1, 2 Автоматизированные платформы3	АмплиТест МБТ-Резист-I Амплитуб-МЛУ-РВ MTB-RESIST-I-тест ТБ-Биочип-14 ТБ-ТЕСТ4
• этионамиду	Xpert MTB/XDR1	Нет
• пиразинамиду	Genoscholar PZA-TB II5	Нет
• стрептомицину	Нет	MTB-RESIST-II-тест ТБ-ТЕСТ4
• этамбутолу	Нет	ТБ-ТЕСТ4
• амикацину/канамицину	Xpert MTB/XDR1 GenoType MTBDRsl2, 5	MTB-RESIST-II-тест ТБ-ТЕСТ4
• капреомицину	GenoType MTBDRsl2, 5	ТБ-ТЕСТ4
• фторхинолоны	Xpert MTB/XDR1 GenoType MTBDRsl2, 5	Амплитуб-FQ-РВ MTB-RESIST-II-тест ТБ-БИОЧИП-24 ТБ-ТЕСТ4
• линезолиду, бедаквилину, деламаниду	Нет	Нет
Сполиготипирование	Нет	Сполиго-Биочип4 ТБ-ТЕСТ4 Амплитуб-Beijing8

¹ Картриджная технология.

² Зарегистрированы в России.

³ Платформы RealTime MTB и MTB RIF/INH (Abbott, США), BD MAX MDR-TB (Becton-Dickinson, США), FluoroType MTB and MTBDR (Bruker, США (ранее Hain Lifescience, Германия)), Сobas MTB and MTB-RIF/INH (Roche, Швейцария).

⁴ Гибридизационная технология, биочипы.

⁵ Гибридизационная технология, ДНК-стрипы.

⁶ Дифференциация M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG.

⁷ В процессе регистрации.

⁸ Только для научных исследований.

Примечание: МБТК — микобактерии туберкулезного комплекса; НТМБ — нетуберкулезные микобактерии; АмплиСенс МБТ-Eph (ФСР 2009/04066 от 27.03.2019), АмплиСенс MTC-diff-FL (ФСР 2012/13301 от 22.03.2019), АмплиСенс MTC-FL (ФСР 2010/09556 от 13.03.2019), ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия; АмплиТест МБТ-Резист-I (РЗН 2022/16720 от 16.05.2022), ФГБУ «ЦСП» ФМБА России; Амплитуб-МЛУ-РВ (ФСР 2010/07636 от 12.10.2017), Амплитуб-Преп-Реагент (РЗН 2017/6634 от 26.12.2017), Амплитуб-РВ (ФСР 2010/07635 от 12.10.2017), Амплитуб-Beijing, Амплитуб-FQ-РВ (РЗН 2017/5772 от 26.05.2017), «НПФ Синтол», Россия; Амплитуб-НТМБ-дифференциация, Амплитуб-РВ+НТМБ, разработчики — «НПФ Синтол» и ФГБНУ «ЦНИИТ»; МИКО-ГЕН (ФСР 2008/03849 от 25.11.2016), — «НПО ДНК-Технология», Россия; РеалБест ДНК МВТС (РЗН 2017/6051 от 04.08.2017), производитель — «Вектор-Бест», Россия; Сполиго-Биочип (ФСР 2012/13826 от 23.03.2021), ТБ-Биочип-1 (ФСР 2011/10088 от 13.07.2021), ТБ-Биочип-2 (ФСР 2010/08555 от 24.08.2021), ТБ-ТЕСТ (РЗН 2014/1709 от 11.02.2021), «БИОЧИП-ИМБ», Россия; МТВ-тест (РЗН 2022/18162 от 31.08.2022), MTB-RESIST-I-тест (РЗН 2022/18653 от 31.10.2022), MTB-RESIST-II-тест (РЗН 2022/19258 от 28.12.2022), «ТестГен», Россия; GenoType MTBDRplus, GenoType MTBDRsl, FluoroType MTB (Bruker, США (ранее Hain Lifescience, Германия)); Genosholar NTM+MDRTB, Genoscholar PZA-TB II (Nipro, Япония); Loopamp MTBC Detection Kit (Eiken Chemical Company, Япония); Truenat MTB, Truenat MTB Plus, Truenat MTB-RIF Dx (Molbio Diagnostics, Индия); Xpert MTB/RIF, Xpert MTB/RIF Ultra, Xpert MTB/XDR (Cepheid, США).

 

Для определения генотипической лекарственной устойчивости необходимо провести ряд последовательных процедур: выделение ДНК, определение наличия в образце M. tuberculosis и далее — генотипической чувствительности [41]. Для выделения ДНК существует достаточно много отечественных наборов реагентов, широко внедряется автоматизация процессов выделения с использованием «открытых» автоматических станций, позволяющих использовать любые реактивы и расходные материалы. Такой подход увеличивает пропускную способность лабораторий, снижает риск контаминации и вероятность ошибок, обусловленных человеческим фактором.

Следующим шагом алгоритма определения генотипической лекарственной чувствительности M. tuberculosis является подтверждение наличия в образце ДНК M. tuberculosis. Отечественные диагностические наборы, позволяющие проводить этот анализ, достаточно разнообразны, но предпочтение следует отдавать наборам с регистрацией результата реакции в режиме реального времени, так как это минимизирует риск контаминации и снижает материальные и трудовые затраты. На этом этапе целесообразно дифференцировать МБТК от НТМБ, так как недиагностированная инфекция, вызванная НТМБ, может проходить под маской ШЛУ-ТБ вследствие природной устойчивости НТМБ ко многим противотуберкулезным препаратам. До недавнего времени для видовой идентификации НТМБ применялись наборы GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience, Германия), но сейчас эти наборы в Россию не поставляются. Учитывая важность этого этапа диагностики, в ЦНИИТ совместно с «НПФ Синтол» разрабатываются две тест-системы, основанные на мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, одна из которых позволяет дифференцировать НТМБ от МБТК, а вторая — проводить видовую идентификацию 12 клинически значимых видов НТМБ.

После подтверждения наличия в образце ДНК M. tuberculosis проводятся тесты на определение генотипической лекарственной чувствительности. Сейчас доступны ПЦР-тесты и биочипы для определения устойчивости к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам, а также биочипы, позволяющие проводить исследование одновременно на установление генотипа возбудителя с определением генетических детерминант лекарственной устойчивости к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, амикацину и канамицину, капреомицину и этамбутолу, однако определение устойчивости к аминогликозидам / циклическим пептидам имеет невысокую чувствительность.

Следовательно, на данном этапе развития основанные на ПЦР тесты для определения генотипической лекарственной чувствительности с высокой степенью достоверности способны определить резистентность к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам. В целом такого набора препаратов достаточно для того, чтобы выделять группы больных туберкулезом с МЛУ и пре-ШЛУ возбудителя, но для максимально полного охвата спектра лекарственных препаратов, к которым приобретена устойчивость, сохраняют актуальность культуральные методы определения лекарственной чувствительности.

Важно проводить исследования, направленные на поиск генетических детерминант устойчивости к новейшим противотуберкулезным препаратам — линезолиду, бедаквилину, деламаниду, которые лягут в основу ПЦР-тестов, позволяющих определять устойчивость к этим антибиотикам. В ЦНИИТ сейчас проводятся исследования по этому направлению.

Также важен поиск генетических детерминант устойчивости к ПАСК, циклосерину, теризидону, так как чувствительность к этим препаратам нельзя определить даже культуральным методом: критические концентрации для этих препаратов не разработаны для тестов лекарственной чувствительности методом пропорций на плотных и жидких питательных средах, которые сейчас рекомендованы для определения фенотипической чувствительности M. tuberculosis [4].

Для повышения диагностической значимости тестов по определению генотипической устойчивости к аминогликозидам / циклическим пептидам, возможно, требуются дополнительные исследования генетического фона штаммов, которые позволят объяснить причины, по которым одна и та же мутация ассоциирована с устойчивостью у одних штаммов и не приводит к развитию устойчивости у других.

Определение устойчивости к пиразинамиду методом ПЦР, выявляющим конкретные точечные мутации, невозможно, поскольку при устойчивости к этому препарату выявляется очень широкий спектр мутаций, поэтому теста, основанного на ПЦР, для определения генотипической устойчивости к пиразинамиду не существует.

Таким образом, внедрение в диагностический алгоритм современных методов, основанных на ПЦР, позволяет успешно разделять потоки пациентов по характеру лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза. Разработка и внедрение новых тестов, способных предоставить высокодостоверные данные по лекарственной устойчивости к широкому спектру противотуберкулезных препаратов, включая новейшие, позволяют существенно повысить эффективность терапии туберкулеза с лекарственной устойчивостью возбудителя и не допустить распространения устойчивых клонов.

Заключение

Расширение представлений о механизмах формирования устойчивости M. tuberculosis и биологических свойствах устойчивых вариантов является приоритетной задачей в условиях глобального распространения туберкулеза с лекарственной устойчивостью возбудителя. В процессе адаптации к противотуберкулезной терапии M. tuberculosis приобретают мутации в генах, кодирующих мишени препаратов или ферменты, активирующие пролекарства. Появление таких мутаций неоднозначно влияет на биологические свойства M. tuberculosis: если мутации не оказывают негативного влияния на жизнеспособность или их негативное влияние минимально, то M. tuberculosis с такими мутациями получают эволюционное преимущество и способны широко распространяться в популяции. Последовательное накопление мутаций дает возможность M. tuberculosis выработать устойчивость к большому спектру существующих противотуберкулезных препаратов, а специфические механизмы компенсации стабилизируют жизнеспособность и трансмиссивность возбудителя. Поэтому даже после появления новых противотуберкулезных препаратов всегда существует угроза, связанная с появлением новых устойчивых штаммов M. tuberculosis. Вовремя выявленная устойчивость M. tuberculosis и соответствующим образом скорректированная схема терапии позволят предотвратить амплификацию лекарственной устойчивости и повысить эффективность лечения.

Благодаря достижениям в области геномики и биологии возбудителя были расширены представления о разнообразии механизмов устойчивости M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, которые должны использоваться для разработки новых инструментов диагностики, позволяющих быстро и точно выявлять возбудителя туберкулеза и определять как можно более широкий спектр резистентности.

Широкое внедрение секвенирования для определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis в современных условиях не представляется целесообразным, так как требует слишком больших изменений инфраструктуры, но при этом не предоставляет высокодостоверных данных по устойчивости к большинству противотуберкулезных препаратов. Однако этот инструмент может и должен применяться в крупных исследовательских центрах для фундаментальных исследований, направленных на развитие представлений о механизмах возникновения лекарственной устойчивости, биологических свойствах лекарственно-устойчивых M. tuberculosis и особенностях их распространения.

По мере расширения представлений о биологии лекарственно-устойчивых M. tuberculosis и развития технологий секвенирования в сторону большей доступности и облегчения интерпретации полученных массивов данных значение секвенирования как инструмента диагностики будет возрастать.

Перспективными в области изучения биологии лекарственно-устойчивых M. tuberculosis представляются следующие направления исследований: мониторинг частоты мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, в различных регионах для разработки максимально адаптированных молекулярных тестов; улучшение понимания взаимосвязи между генотипом и фенотипом M. tuberculosis с учетом генетического фона, сопровождающего мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью; изучение влияния эпистаза нескольких мутантных генов, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, на биологические свойства M. tuberculosis с МЛУ, пре-ШЛУ и ШЛУ. Научные достижения в этих областях позволят выработать новые подходы для диагностики и лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза и обеспечить эффективную персонализированную терапию.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Финансирование работы осуществлено в рамках бюджетного финансирования по месту работы авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. А.Э. Эргешов — разработка идеи статьи, поисково-аналитическая работа с литературными источниками, формулирование заключения, редактирование статьи; С.Н. Андреевская — поисково-аналитическая работа с литературными источниками, написание текста статьи; Т.Г. Смирнова — поисково-аналитическая работа с литературными источниками, написание текста статьи; Л.Н. Черноусова — поисково-аналитическая работа с литературными источниками, редактирование статьи. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию рукописи статьи и ее направление на публикацию. Все авторы согласны нести ответственность за все аспекты работы, чтобы обеспечить надлежащее рассмотрение и решение всех возможных вопросов, связанных с корректностью и надежностью любой части работы.

About the authors

Atadzhan E. Ergeshov

Central TB Research Institute; A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Author for correspondence.
Email: ctri@ctri.ru
ORCID iD: 0000-0002-2494-9275

MD, PhD, Professor, Corresponding Member of the RAS

Россия, Moscow; Moscow

Sofya N. Andreevskaya

Central TB Research Institute

Email: andsofia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4589-6133

MD, PhD, Senior Researcher

Россия, Moscow

Tatyana G. Smirnova

Central TB Research Institute

Email: s_tatka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2886-1745

MD, PhD

Россия, Moscow

Larisa N. Chernousova

Central TB Research Institute

Email: lchernousova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6288-7549

PhD in Biology, Professor

Россия, Moscow

References

Supplementary files