A Prospective Multicenter Randomized Study State of Humoral Immunity after a New Coronavirus Infection (COVID-19) of a Mild or Asymptomatic Course

Full Text

Обоснование

Новая коронавирусная инфекция — COVID-19 (COronaVIrus Disease – 2019) — стремительно распространилась по всему миру после своего дебюта в середине декабря 2019 г. в китайском городе Ухань, провинция Хубэй [1]. Китай стал эпицентром пандемии, вызванной новым коронавирусом, названным Международным комитетом по таксономии вирусов SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2), который является антропозоонозом II группы патогенности [2]. Важными особенностями инфекции, определившими в том числе быстрое распространение заболевания, являются возможность заражения от больного человека, находящегося в инкубационном периоде (от 2 до 14 сут), и значительное количество лиц, переносящих болезнь в легкой/ бессимптомной форме [1, 3, 4].

Тяжесть и прогноз у пациентов с COVID-19 в основном определяются развитием гипервоспалительной реакции (гипотеза «цитокинового шторма») [5], которая не только приводит к формированию острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), но и одновременно с этим повышает риск жизнеопасных коагулопатий [6].

Жертвами пандемии COVID-19 стало огромное количество людей во всем мире. «Золотой стандарт» диагностики — обнаружение нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) — часто не дает 100% точного диагноза. В некоторой степени обнаружение антител, специфичных для SARS-CoV-2, может восполнить недостаток методики ОТ-ПЦР. Исследования показали, что в случаях подозрения на COVID-19 с отрицательной нуклеиновой кислотой специфические антитела являются эффективным дополнительным индикатором инфекции SARS-CoV-2 и могут быть объединены с ОТ-ПЦР для подтверждения инфекции. J. Xie et al. (2020) также считают, что комбинация ОТ-ПЦР и теста на антитела IgM-IgG является оптимальным методом диагностики инфекции SARS-CoV-2 [7, 8]. Связано это с тем, что при COVID-19 порядок появления антител IgM и IgG имеет отличительную особенность — IgM и IgG могут синтезироваться почти одновременно. Как правило, при заболевании антитела вырабатываются как к нуклеокапсидному (N), так и к гликопротеиновому спайковому (S) белку SARS-CoV-2. Наличие антител против N-белка может указывать на предшествующий контакт с SARS-CoV-2 или родственными вирусами, но не обязательно свидетельствует о наличии нейтрализующих антител. Серологическое тестирование на основе только N-белка для определения потенциального иммунитета против COVID-19 сомнительно [9]. Поэтому для оценки гуморального иммунитета используются методы по определению титра вируснейтрализующих антител (IgG) к S-белку SARS-CoV-2. Выявление IgМ к S-белку подтверждает наличие иммунного ответа к COVID-19 после контакта с вирусом.

Количественное обнаружение IgG к S-белку (вируснейтрализующие антитела) позволяет судить о наличии иммунитета, который может сформироваться как после перенесенного заболевания, так и после вакцинации. Сведения о защитном титре антител и о том, как долго он сохраняется, в настоящее время отсутствуют [4, 10]. Проведенные ранее исследования родственных коронавирусов MERS-CoV и SARS-CoV-1, а также сезонных коронавирусов демонстрируют, что после инфекции SARS-CoV-1 концентрация IgG оставалась высокой на протяжении 4–5 мес, а затем в течение 2–3 лет постепенно снижалась, при этом до 90% переболевших сохраняли вируснейтрализующие антитела через 2,5 года. Аналогичным путем развивался иммунный ответ при MERS-CoV-инфекции с сохранением антител у выздоровевших до 34 мес [11, 12].

Время нарастания уровней специфических IgM и IgG в крови у обследуемых лиц различается, и комбинированное обнаружение может быть более полезным для диагностики COVID-19 [10]. Масштабные популяционные исследования в условиях пандемии позволяют определить различные закономерности в выработке иммунного ответа на новую коронавирусную инфекцию, способствуют раннему выявлению и улучшению оказания помощи таким пациентам. Некоторые страны Евросоюза также запустили программы массового скрининга IgG к SARS-CoV-2 в популяции с целью оценки гуморального иммунитета у населения и выявления количества переболевших лиц. Массовая оценка гуморального иммунитета является необходимой частью стратегии дальнейшей борьбы с пандемией COVID-19 [13].

Следует отметить и то, что на настоящий момент отсутствуют высокоэффективные этиотропные препараты для лечения COVID-19, которые бы влияли на общую смертность и наступление потребности в вентиляции легких. Эффективность в терапии тяжелой и критической формы новой коронавирусной инфекции доказали только системные глюкокортикостероиды, что, очевидно, недостаточно в борьбе с пандемией COVID-19 [14, 15]. Поэтому, помимо разработки перспективных методов лечения пациентов с использованием передовых лекарственных препаратов, следующим шагом в борьбе с пандемией является масштабная вакцинация населения. Вместе с тем проведение вакцинации в условиях неопределенности в отношении состояния иммунитета у лиц, перенесших COVID-19, в том числе у лиц, перенесших заболевание в бессимптомной форме, мало изучено, а значит, чревато непредсказуемыми реакциями и осложнениями. Данные европейских исследователей показывают, что, несмотря на обширный скрининг с помощью ОТ-ПЦР-теста, в значительной части случаев инфекция не была обнаружена, что, возможно, обусловлено малосимптомным и легким течением COVID-19 [16].

Таким образом, в каждой популяции имеется доля лиц, перенесших COVID-19 в инаппарантной форме. Однако зарубежные и отечественные исследования по изучению иммунитета против COVID-19 в основном проводятся среди лиц, получающих стационарное лечение и перенесших среднетяжелые и тяжелые формы заболевания [17, 18].

Следует заключить, что исчерпывающей информации о состоянии гуморального иммунитета у лиц, перенесших легкие формы COVID-19 в Российской Федерации, недостаточно. Настоящее исследование, посвященное изучению особенностей гуморального иммунитета у лиц, перенесших COVID-19 в легкой или бессимптомной форме, является одним из первых в России.

Цель исследования — изучить динамику формирования нейтрализующих антител к S-белку SARS-CoV-2 и особенности гуморального иммунитета у лиц, перенесших COVID-19 в легкой или бессимптомной форме.

Методы

Дизайн исследования

Проведено проспективное когортное нерандомизированное исследование.

Объект исследования — пациенты, перенесшие новую коронавирусную инфекцию легкого или бессимптомного течения, подтвержденную положительным результатом ОТ-ПЦР-теста. С целью набора амбулаторных пациентов в исследование был создан специальный сайт лабораторной службы «Хеликс» (https://otklik.helix.ru), на котором любой желающий мог подать заявку на участие в исследовании в электронном виде. Для автоматизированной обработки заявок на сайте был реализован алгоритм оценки соответствия потенциальных участников критериям включения. Первичным критерием отбора являлось наличие у респондента положительного результата ПЦР-исследования мазка из верхних дыхательных путей на SARS-COV-2, выполненного в лабораторной службе «Хеликс». Для этой цели потенциальному участнику предлагалось ввести уникальный номер заказа, который автоматически сверялся с базой данных положительных результатов ПЦР-исследований на SARS-COV-2, осуществленных в «Хеликс». При подтверждении наличия у потенциального участника результата ПЦР-исследования, соответствующего критериям включения, он сразу же допускался к прохождению анкетирования в электронном виде. Результаты анкетирования при помощи алгоритма автоматически оценивались на предмет соответствия критериям включения в исследование. При соответствии критериям анкета и контактные данные участника автоматически пересылались ответственному врачу-исследователю «Хеликса», который связывался с ним по телефону для валидации предоставленных данных, подробного разъяснения сути проводимого исследования и условий включения в него. При получении подтверждения участия в исследовании врач-исследователь делал соответствующую отметку в базе данных, запуская процесс периодической автоматизированной рассылки участнику по электронной почте и в SMS подробных инструкций о дальнейших действиях. Рассылка по электронной почте включала срок явки и перечень диагностических центров, куда может обратиться участник для сдачи крови на исследование антител, а информационное SMS содержало номер предварительного заказа на исследование, сообщение которого администратору максимально сокращало время оформления документов, автоматизировало выбор необходимого исследования для сдачи и предоставляло участнику право бесплатной сдачи анализа в диагностическом центре «Хеликс». Рассылка осуществлялась автоматически, исходя из сроков сдачи биоматериала, индивидуально рассчитанных для каждого из участников в соответствии с принятыми в исследовании контрольными точками.

Критерии соответствия

Критерии включения в исследование пациентов:

• мужчины и женщины, перенесшие COVID-19, подтвержденную положительным результатом ОТ-ПЦР-теста;
• дата сдачи анализа на COVID-19 более 10 дней от момента клинического выздоровления участников исследования и подачи заявки на участие с получением результата в лабораторной службе «Хеликс»;
• возраст участников исследования в пределах от 18 до 70 лет включительно;
• отсутствие беременности и периода лактации;
• отсутствие аутоиммунных (ревматологических), онкологических заболеваний в анамнезе;
• желание участвовать в исследовании, которое подтверждалось подписанным согласием.

Условия проведения

Лабораторные исследования проводились лицам из 22 населенных пунктов на базе трех лабораторных комплексов компании «Хеликс», расположенных в Санкт-Петербурге, Москве и Екатеринбурге.

Продолжительность исследования

Совместное научное исследование проводилось в период с 01.06.2020 по 01.08.2021.

Исходы исследования

Основной исход исследования: выявлены специфические титры антител класса IgG к S1/S2 вируса SARS-CoV-2 в человеческой сыворотке в количественном значении. Определена динамика сохранения титра антител.

Анализ в подгруппах

Включенные в исследование пациенты были разделены на две группы по полу. Также осуществлена стратификация на следующие возрастные подгруппы согласно классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ): 18–44 года (молодые люди) — группа 1 (799 участников, 71,93%); 45–59 лет (люди среднего возраста) — группа 2 (263 участника, 24,29%); 60–70 лет (люди пожилого возраста) — группа 3 (47 участников, 3,78%) [19].

Описание медицинского вмешательства

Всем пациентам в каждой из точек исследования выполнялось количественное определение специфических антител класса IgG к S1/S2 вируса SARS-CoV-2 в 5 мл человеческой сыворотки или плазме методом хемилюминесцентного иммуноанализа (CLIA) с помощью иммунохимического автоматического анализатора LIASON XL (DiaSorin, Italy). Реагенты: LIAISON^® SARS-CoV-2 S1/ S2 IgG. Полученные результаты выражались в принятых для обозначения для данного анализатора и тест-системы условных единицах — ОЕ/мл (относительная единица на миллилитр). Мерой количественной величины, определяющей интенсивность гуморального ответа на S-белок, являлись значения IgG к S1/ S2 в соответствующих референсных пределах для данной аппаратуры: 0,0–12,0 ОЕ/мл — отрицательный (отсутствие антител и, как следствие, гуморального иммунитета); 12,0–15,0 ОЕ/мл — сомнительный; свыше 15 ОЕ/мл —положительный.

Этическая экспертиза

Все процедуры с участием человека, запланированные в клиническом исследовании, были рассмотрены и утверждены этическим комитетом Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (протокол от 27 апреля 2021 г. № 249).

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки. Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных. Статистическая обработка данных выполнялась в программе Statistica 12 (StatSoft, Inc.). Поскольку все показатели в исследуемых группах имели распределение, отличное от нормального для исследования влияния пола и возраста на содержание в крови специфических IgG, использовался двухфакторный дисперсионный анализ на рангах — rank ANOVA (данные ранжируются, а затем проводится обычный ANOVA). Количественные переменные представлены в виде медианы и 25% и 75% квартилей (Me (Q25%; Q75%)), качественные — в абсолютных числах и процентах. Значимыми считали различия с значениями р < 0,05.

Результаты

Объекты (участники) исследования

Промежуточные результаты исследования включают анализ данных, касающихся 1109 лиц мужского и женского пола в возрасте от 18 до 70 лет (средний возраст 38,2 года), получивших амбулаторное лечение по поводу легкой или бессимптомной формы заболевания. Исходные характеристики пациентов, а также данные ANOVA — анализа пациентов, включенных в исследование, отражены в табл. 1. Как видно из данных, представленных в табл. 1, группы были однородны по полу и возрасту, статистически значимо не различались. Наибольшее количество пациентов было в возрастной группе молодых, а общее количество пациентов позволяет использовать необходимые статистические методы.

 

Таблица 1. Результаты ANOVA — содержания титра нейтрализующих антител в крови у пациентов, включенных в исследование, в зависимости от пола и возраста

Table 1. ANOVA results - content of neutralizing antibody titer in blood in patients included in the study, depending on gender and age

Группа	Женщины			Мужчины			ANOVA-анализ
							P1	P2
Возраст, лет	18–44	45–59	60–70	18–44	45–59	60–70
Подгруппы	1 (Ж1)	2 (Ж2)	3 (Ж3)	1 (М1)	2 (М2)	3 (М3)
Общее количество участников, абс. (%)	494 (72,12)	169 (23,16)	31 (4,53)	305 (71,93)	103 (24,29)	16 (3,77)
Сывороточная концентрация IgG, Ме (Q25%; Q75%): • 30 сут	36,4 (13,7;58,8)	42,65 (24,4;70,3)	63,5 (24,6;95,4)	46,8 (22,8;71,6)	42,1 (19,6;70,0)	63,8 (16,3;134,7)	0,660	0,173
• 45 сут	38,6 (18,7;64,8)	36,8 (21,2;74,3)	58,4 (47,3;87,6)	43,6 (22,3;73,95)	46 (19,5;71,1)	65,7 (38,8;72,1)	0,647	0,02
• 60 сут	38,7 (18,4; 67,4)	44,9 (22,8;74,5)	63,3 (29,2;113)	43,2 (19,6;72,8)	41,8 (18,3;74,1)	68,4 (56,3;120)	0,450	0,003
• 90 сут	33,6 (15,5; 56,7)	45,5 (18,8;73,2)	62,4 (14,2;109,7)	34,9 (17;67,3)	42,3 (18,5;69)	72,8 (40,9; 89,7)	0,011	0,003
Доля лиц без антител 30 сут, абс. (%)	4 (0,9)	0 (0,0)	0 (0,0)	2 (0,8)	0 (0,0)	0 (0,0)	–
Итого участников по полу, абс.	685			424			0,79
Всего, абс.	1109

 

Основные результаты исследования

Данные через 30 сут после последнего положительного ПЦР-теста. По данным проведенного анализа АNOVA rank, в первой точке исследования (30 сут) влияние всех факторов было незначимым (р = 0,66 для пола, р = 0,17 для возрастных групп, р = 0,076 для взаимодействия пола и возраста). Это говорит об отсутствии влияния гендерного фактора и возраста на титр антител в ранний срок после перенесенной инфекции. Стоит также отметить, что выявлялись лица, не имеющие нейтрализующих антител на 30-е сут исследования. Это совпадает с результатами проведенных исследований в других странах, где также отмечено более позднее повышение антител против SARS-CoV-2 [19].

Данные через 45 сут после последнего положительного ПЦР-теста. Данные анализа показали, что модель ANOVA rank была значима во второй точке исследования — 45 сут (р < 0,0001), при этом влияние пола в модели было несущественно (р = 0,647), а влияние возраста и их взаимодействия (р = 0,20 и р = 0,055) — статистически значимым (рис. 1). Анализируя рис. 1, следует отметить (в отличие от мужчин) тенденцию у лиц женского пола к увеличению титра антител во 2-й и 3-й подгруппах. Стоит подчеркнуть, что в этот период у 100% лиц, участвовавших в исследовании, состоялась выработка нейтрализующих антител.

Данные через 60 сут после последнего положительного ПЦР-теста. В 3-й точке исследования модель ANOVA была значимой (р = 0,003), влияние пола и влияние взаимодействия не показали статистически значимых различий (р = 0,45 и р = 0,51 соответственно), при этом сохранялось статически значимое воздействие возраста на титр IgG (р = 0,003).

Данные через 90 сут после последнего положительного ПЦР-теста. Через 90 сут исследования модель ANOVA rank была значима (р = 0,002), в целом в данной точке сохранялись предшествующие тенденции: влияние пола и влияние взаимодействия оставались несущественными (р = 0,11 и р = 0,09 соответственно), а возраст являлся статистически значимым действующим фактором — (р = 0,003).

Резюмируя вышесказанное, можно следующим образом представить итоговые графики влияния пола и возраста на титр IgG против SARS-CoV-2 (см. рис 1).

Нежелательные явления

Нежелательных явлений не отмечалось.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

В нашем исследовании впервые продемонстрированы тренды выработки антител среди мужчин и женщин в разных возрастных группах. При их анализе можно заключить, что начиная с 45-х сут и до 90-х сут старший возраст и женский пол ассоциированы с более высоким титром IgG после COVID-19 легкого или бессимптомного течения.

Обсуждение основного результата исследования

По данным промежуточных результатов исследования, включающим оценку динамики IgG у лиц с легким или бессимптомным течением COVID-19 за первые 90 сут наблюдения, можно сделать следующие выводы.

Через 30 сут после перенесенной инфекции в легкой форме антитела класса IgG к S-белку возбудителя SARS-CoV-2 не определялись лишь у 0,9% женщин молодого возраста и 0,8% мужчин той же возрастной категории. В других возрастных группах антитела определялись у всех участников исследования.

 

Рис. 1. Динамика выработки антител в зависимости от возраста и пола

Fig. 1. Dynamics of antibody production depending on age and gender

 

Титр антител постепенно нарастает до наибольшего значения через 45 сут с сохранением этого уровня к 60 сут и последующей тенденцией к снижению к 90 сут от начала заболевания.

На 45-е сут антитела определяются у всех участников исследования, что свидетельствует об обязательном формировании гуморального иммунитета у пациентов, перенесших COVID-19 в легкой и бессимптомной форме.

Сывороточные или плазменные IgG-антитела против SARS-CoV-2 сохраняются в течение как минимум 90 сут после перенесенной инфекции в легкой или бессимптомной форме.

Анализируя полученные результаты, необходимо учесть, что выбранная когорта лиц характеризовалась наиболее благополучным исходом среди пациентов, перенесших COVID-19, что может свидетельствовать о состоятельности основных механизмов их Т-клеточного и В-клеточного иммунитета. По-видимому, именно поэтому при адекватном адаптивном иммунитете старшая возрастная группа отличалась более высокими концентрациями антител, поскольку их иммунная система имела большее количество предъявлений различных антигенов в течение жизни и более выраженно реагирует на новую коронавирусную инфекцию, чем лица более молодого возраста [20].

Не менее важными являются факт влияния пола на динамику IgG к S-белку возбудителя SARS-CoV-2 и продолжительность их сохранения после перенесенной инфекции. Ранее состоявшиеся исследования продемонстрировали, что у женщин развивается более быстрый и выраженный гуморальный ответ на инфекции и вакцинации, обусловленный уровнем половых гормонов [21, 22]. Экспериментальные исследования на мышах показали, что эстрогены стимулируют, а тестостерон может подавлять выработку антител, в клинических исследованиях описана более низкая продукция IgG при вакцинации против гриппа у мужчин, особенно у мужчин с высоким уровнем тестостерона во время иммунизации [21, 23, 24]. Результаты этих исследований демонстрируют важную роль половых гормонов в формированиии иммунного ответа на патоген. Эти данные и полученные результаты нашего исследования убедительно свидетельствуют о том, что женщины обладают преимуществом в формировании более быстрого и мощного гуморального иммунитета в отношении SARS-CoV-2, что может привести к клинической пользе для женщин в отношении течения и исходов заболевания. Несмотря на непродолжительный — 90-дневный — период наблюдения в нашем исследовании, по имеющемуся тренду можно предположить более быстрое снижение титра антител у мужчин по сравнению с женщинами, что соотносится с непродолжительной персистенцией антител у мужчин в отношении SARS-CoV-2 [25]. Этот феномен следует учитывать при планировании клинических исследований, направленных на изучение вмешательств, усиливающих противовирусные механизмы, блокирующих гипервоспалительную реакцию, а также при изучении постинфекционного иммунитета, способов его активации и продления.

Ограничения исследования

Ограничениями исследования являются непродолжительный период наблюдения, составляющий 90 сут, отсутствие типирования штаммов/версий SARS-CoV-2, а также отсутствие в исследовании пациентов со среднетяжелым и тяжелым течением COVID-19, что не позволяет связать выраженность иммунного ответа и его продолжительность с тяжестью перенесенной инфекции. Данные ограничения будут реализованы в следующих этапах исследования.

Заключение

Данные проведенного исследования характеризуют сроки формирования и продолжительность сохранения IgG к SARS-CoV-2 у пациентов, перенесших COVID-19 в легкой или бессимптомной форме. На 45-е сут антитела определялись у всех участников исследования, что свидетельствует о формировании постинфекционного гуморального иммунитета, который при легком или бессимптомном течении COVID-19 сохранялся у пациентов в течение как минимум 3 мес, при этом с 45-х и до 90-х сут старший возраст и женский пол ассоциированы с более высоким титром IgG.

Таким образом, возраст и пол являются факторами, влияющими на гуморальный иммунный ответ к SARS-CoV-2.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование и публикация статьи осуществлены за счет бюджетных средств организаций.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо

сообщить.

Участие авторов. Д.В. Тришкин — концепция и дизайн статьи, анализ литературы, написание текста, редакционная правка; Е.В. Крюков — концепция и дизайн статьи, анализ литературы, написание текста, редакционная правка; В.В. Салухов — концепция и дизайн исследования, концепция и дизайн статьи, анализ литературы, написание текста, редакционная правка; А.А. Андрейчук — концепция и дизайн исследования, концепция и дизайн статьи, анализ литературы, написание текста, редакционная правка; Б.Н. Котив — анализ литературы, написание текста; Д.В. Овчинников — анализ литературы, написание текста; Ю.В. Рудаков — анализ литературы, написание текста; П.С. Садовников — анализ литературы, написание текста; М.А. Харитонов — анализ литературы, написание текста; А.А. Чугунов — анализ литературы, написание текста, подготовка рисунков; Д.Г. Денисов — анализ литературы, написание текста, подготовка рисунков. Все авторы подтверждают, что они соответствуют критериям авторства ICMJE.

About the authors

Evgeniy V. Kryukov

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: evgeniy.md@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8396-1936
SPIN-code: 3900-3441

MD, PhD, Professor, Corresponding Member of the RAS

Россия, 6, Akademika Lebedeva str., 194044, St. Petersburg

Dmitriy V. Trishkin

The Main Military Medical Directorate

Email: vmeda-nio@mil.ru
SPIN-code: 1082-0719

MD, PhD

Россия, Moscow

Vladimir V. Salukhov

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Author for correspondence.
Email: vlasaluk@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1851-0941
SPIN-code: 4531-6011

MD, PhD

Россия, 6, Akademika Lebedeva str., 194044, St. Petersburg

Pavel S. Sadovnikov

Laboratory Service “Helix”

Email: sadovnikov.p@helix.ru
ORCID iD: 0000-0002-6022-5709
SPIN-code: 1542-2836
Россия, St. Petersburg

Yuriy V. Andreychuk

Laboratory Service “Helix”

Email: andreychuk.y@helix.ru
ORCID iD: 0000-0003-2016-8815
Россия, St. Petersburg

Alexander A. Chugunov

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: alexandrchugun@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2532-6133
SPIN-code: 3839-7619

Adjunct

Россия, 6, Akademika Lebedeva str., 194044, St. Petersburg

Bogdan N. Kotiv

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: kotivbn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7537-1218
SPIN-code: 4038-0855

MD, PhD, Professor

Россия, 6, Akademika Lebedeva str., 194044, St. Petersburg

References

Supplementary files