Placental Microbiome: a Paradigm Shift or Flaw in the Methodology?

Full Text

Введение

Широкое внедрение технологий высокопроизводительного секвенирования ДНК в клиническую микробиологию позволило существенно расширить представления о микробиоте и микробиоме (совокупном геноме микробиоты) человека в норме и при различных заболеваниях. Последние несколько лет ознаменовались интенсивными исследованиями микробиоты верхних отделов репродуктивного тракта женщины, а также плаценты и плода. Впервые предположение о существовании резидентной (физиологической) микробиоты плаценты было сделано в 2014 г., когда К. Aagaard et al. сообщили о выявлении бактериальной ДНК в образцах плаценты, в том числе при доношенной беременности [1]. Сопоставление бактериальных сообществ плаценты с бактериальными сообществами других органов и систем показало сходство с микробиотой ротовой полости, что навело авторов на мысль о возможном происхождении микробиоты плаценты. Эта работа стала первой в череде исследований, характеризующих микробиоту плаценты, амниотической жидкости и плода, а также различия в микробиоте плаценты при различных акушерских состояниях [2–11].

Важнейшим следствием существования резидентной микробиоты плаценты представлялась вероятность того, что формирование микробиоты человека начинается еще в утробе матери, а не во время или сразу после родов, как считалось ранее. Эти представления не соответствовали хрестоматийным представлениям о стерильности матки и плода при здоровой беременности, зиждущимся на выверенной десятилетиями доказательной базе. Одним из самых важных аргументов в пользу стерильности беременной матки и ее содержимого является незрелость иммунной системы развивающегося плода для создания симбионтных отношений с микроорганизмами, преодолевающими плацентарный барьер: способность к трансплацентарной передаче плоду хорошо документирована для целого ряда микроорганизмов и вирусов, однако речь в таких случаях идет об инфекции, часто с тяжелыми последствиями. Другой важный аргумент — богатый и длительный опыт выведения гнотобионтных (безмикробных) животных: успешное выращивание гнотобионтных новорожденных особей в стерильных условиях после стерильно проведенного кесарева сечения описано для целого ряда млекопитающих, включая человека.

Вскоре после этих публикаций последовали работы, ставящие под сомнение существование резидентной микробиоты плаценты и предлагающие альтернативное объяснение выявлению разнообразия бактерий в образцах плаценты и ее содержимого — микробной контаминации [12–18]. Это объяснение основывается на способности современных методов анализа ДНК обнаруживать экстремально низкие уровни бактерий, что делает разделение сигналов в образцах с низкой бактериальной биомассой, к числу которых относятся образцы плаценты и амниотической жидкости, от сигналов в образцах из окружающей среды чрезвычайно трудной задачей. И если контаминация плаценты бактериями родовых путей может быть решена исследованием только образцов, полученных при кесаревом сечении, то повсеместное присутствие бактерий в лаборатории, в том числе в наборах для выделения ДНК, является гораздо более серьезной методологической проблемой.

В данном обзоре литературы проведен анализ результатов исследований на тему микробиома плаценты и приведены аргументы сторонников гипотезы резидентной микробиоты плаценты и их оппонентов. Также очерчены методологические требования к исследованиям биологического материала с низкой микробной биомассой, позволяющие нивелировать влияние микробной контаминации на результаты исследований.

Парадигма стерильности матки при здоровой беременности

Матка и плод при здоровой беременности стерильны — такова исторически сложившаяся точка зрения. Защита плода от микробных патогенов является одной из основных функций плаценты. Для реализации защитной функции плацента имеет целый ряд анатомических, физиологических и иммунологических особенностей, препятствующих бактериальной колонизации [19, 20].

Несмотря на многоуровневую защиту, обеспечиваемую этими барьерами, многие микроорганизмы и вирусы обладают свойствами, позволяющими их преодолевать. К бактериальным агентам, способность которых к трансплацентарной передаче доказана, относятся Treponema pallidum (возбудитель сифилиса), Listeria monocytogenes (возбудитель листериоза), Brucella spp. (возбудитель бруцеллеза), к протозойным — Toxoplasma gondii (возбудитель токсоплазмоза), Plasmodium spp. (возбудитель малярии). Некоторые вирусы (энтеровирусы, вирус Зика, вирус краснухи, парвовирус B19) также способны вызывать трансплацентарную инфекцию [20]. Так, L. monocytogenes использует такие факторы вирулентности, как интерналины (InlA и InlB), листериолизин О (гемолизин) и белок ActA, индуцирующий сборку актина, для преодоления кишечных, плацентарных и гематоэнцефалических барьеров [21]. Необходимость в этих факторах для успешного проникновения в клетки млекопитающих была продемонстрирована путем введения кодирующих эти факторы генов в комменсальные бактерии с использованием плазмидных векторов [22]. Необходимо подчеркнуть, однако, что речь в таких случаях всегда идет об инфекции, часто с тяжелыми последствиями для плода и новорожденного ребенка [20, 23].

Сторонники теории внутриутробной колонизации плода могут возразить, что эпителиальные покровы других органов, содержащих резидентную микробиоту, также обладают рядом анатомических, физиологических и иммунологических особенностей для предотвращения микробной инвазии и борьбы с ней. Однако, говоря о микробиоте, связанной с плодом человека, следует учитывать, что некоторые важные компоненты иммунной системы, необходимые для обеспечения «беcконфликтной» пренатальной взаимосвязи с микробиотой, еще не созданы или еще не созрели у плода. Существенные отличия иммунной системы новорожденных детей от иммунной системы взрослых включают сниженную активность системы комплемента, сниженную способность продуцировать антитела против бактериальных полисахаридных антигенов и повышенное количество наивных Т-клеток и антиген-презентирующих клеток с соответственно наивной функциональной программой [24, 25]. Кроме ограниченного ряда антимикробных пептидов, которые экспрессируются в отдельных отделах плода [26], у плода нет иммунитета, необходимого для успешного преодоления бактериальной инвазии. Кроме того, исследования, описывающие ограниченные иммунные функции очень недоношенных новорожденных, показывают, что сложная иммунная система, необходимая для развития иммунологической толерантности к микробиоте, у плода еще не развита [25, 27]. Наконец тот факт, что кишечная проницаемость у недоношенных детей в течение первых двух дней жизни выше по сравнению со здоровыми доношенными детьми [28], позволяет предположить, что внутриутробный кишечник был бы проницаем для бактерий и способствовал бы конфликтам со слаборазвитой иммунной системой. Таким образом, даже если допустить, что плод колонизируется физиологической микробиотой уже в утробе матери, не ясно, как незрелая иммунная система плода способна ее контролировать.

Ранний эмбрион человека стерилен, в то время как младенец уже вскоре после родов имеет микробиоту, сопоставимую по сложности с микробиотой взрослого человека. Когда и как устанавливается симбиоз между человеком и его микробиотой, является предметом активных исследований. Меконий (первый стул) ребенка уже содержит микроорганизмы, но на сегодняшний день не ясно, является ли это результатом микробной колонизации во время [29] или после [30] родов либо колонизация плода происходит еще в утробе матери. Если колонизация происходит в утробе матери, тогда это имело бы большое значение для формирования ранней иммунной системы человека [31].

Обнаружение микроорганизмов в меконии часто предлагается в качестве доказательства в поддержку гипотезы внутриутробной колонизации. Однако обнаружение бактерий в меконии может быть результатом послеродовой колонизации, особенно если меконий собирается спустя некоторое время после родов. В исследовании R. Hansen et al. (2015) только две трети образцов мекония содержали бактерии, при этом их количество было очень низким [32]. Авторы предположили, что существует «интервал колонизации мекония» — между излитием околоплодных вод и началом анализа мекония, который обеспечивает достаточную возможность размножения микробов, и микробная колонизация кишечника новорожденного происходит очень медленно во время родов и существенно ускоряется после родов. Это исследование подтвердило результаты множества ранних работ (обзор которых представлен недавно M. Perez-Muñoz et al. (2017) [19]) и подчеркнуло, насколько важно дифференцировать «интервал колонизации мекония» при анализе микробиоты кишечника новорожденного.

В пользу парадигмы стерильной матки может также говорить состав первичной микробиоты новорожденного ребенка. Если плод в утробе матери стерилен, первоначальная колонизация микроорганизмами должна зависеть от микробной среды, окружающей ребенка во время родов, и, таким образом, от способа родоразрешения. Напротив, если первичная микробиота приобретается внутриутробно, то профиль первичной микробиоты кишечника новорожденного не должен зависеть от способа родоразрешения. Результаты большинства исследований свидетельствуют, что первичная кишечная микробиота зависит от способа родоразрешения: при вагинальных родах обнаруживаются бактерии влагалища и/или кишечника матери, при кесаревом сечении — бактерии кожи (рис. 1), а с течением времени начинают преобладать типичные для кишечника бактериальные виды [33–38].

Рис. 1. Схематическое представление двух противостоящих концепций формирования первичной микробиоты человека: А — плацента и плод стерильны при здоровой беременности, и кишечная микробиота ребенка формируется во время и после родов, при этом в случае вагинальных родов микробиота новорожденного имеет сходство с микробиотой влагалища матери, в случае кесарева сечения — с микробиотой ее кожи; Б — микробиота плода формируется еще в утробе матери, и ее источником служит микробиота плаценты, которая, в свою очередь, происходит из бактерий кишечника или ротовой полости матери. Адаптировано из: М. Perez-Muñoz et al. [19].

По мнению ряда авторов, наиболее убедительные доказательства против существования резидентной микробиоты в среде, окружающей плод, основаны на успешном опыте получения гнотобионтных животных с помощью кесарева сечения и выращивания их в стерильной среде [19]. Впервые выведение гнотобионтных животных было описано еще в конце XIX в., но только в 1940-х годах исследователи получили стабильно работающую методику выведения гнотобионтных грызунов, которая заключалась в проведении стерильного кесарева сечения и ручном кормлении стерилизованной искусственной пищей в асептическом изоляторе до достижения зрелости. С тех пор было успешно выведено множество разнообразных животных, как мелких, так и крупных [19]. Гнотобионтное потомство может быть получено из обычных животных путем переноса эмбрионов и асептической гистерэктомии (мелкие животные) или асептической гистеротомии (крупные животные). Полагают, таким образом, что сама возможность успешного проведения этих процедур доказывает стерильность среды, окружающей плод, так как даже при низком содержании микроорганизмы колонизировали бы потомство и быстро размножались бы до детектируемого уровня.

Сторонники гипотезы внутриутробной передачи микроорганизмов утверждают, что бактерии, присутствующие в окружающей среде плода, потенциально могут или не колонизировать плод, или оставаться на недетектируемом уровне после рождения. Однако такая ситуация маловероятна. Почти любой микроорганизм быстро и необратимо колонизирует гнотобионтных животных, так как ему нет конкуренции. Еще одним аргументом является то, что из-за ряда физиологических и анатомических различий нельзя проводить аналогию между животными и людьми. Однако описаны случаи (хоть и немногочисленные) создания и поддержания безмикробного статуса у людей с использованием протоколов, аналогичных тем, которые применяются для генерации крупных млекопитающих с помощью асептической гистеротомии. Впервые такой опыт был описан более 50 лет назад [39], в дальнейшем эта процедура применялась при подозрении на тяжелый иммунодефицит плода [40]. Стерильность новорожденных подтверждалась бактериологическими исследования биологических образцов (мекония, кожи), а также образцов с внутренних поверхностей изолятора. В опубликованных случаях сообщалось о продолжительности безмикробного статуса от 6 дней до 3 мес, после которого либо субъекты удалялись из стерильных изоляторов, либо происходила их колонизация микроорганизмами [39–41]. Хотя гнотобионтные люди крайне редки по очевидным причинам, сама возможность их существования говорит в пользу парадигмы стерильности беременной матки.

Гипотеза физиологической микробной колонизации плаценты и плода

Первое предположение о существовании резидентной микробиоты плаценты было сделано K. Aagaard et al. в 2014 г. [1]. С применением высокопроизводительного секвенирования ДНК были охарактеризованы образцы плаценты у более чем 300 женщин, включая женщин со здоровой беременностью, преждевременными родами и случаями антенатальной инфекции в анамнезе. Авторы выделили до 0,002 мг бактериальной ДНК на 1 г плацентарной ткани и обнаружили очень низкий по биомассе, но «метаболически содержательный» микробиом, включающий виды Fusobacterium, Neisseria lactamica, Neisseria polysaccharea, Rhodococcus erythropolis, Propionibacterium acne, Streptomyces overmitilis, Bacteroides spp., Prevotella tannerae, Escherichia coli (последний вид встречался чаще всего). Выявленные бактериальные таксоны и их генные профили сравнили с микробиомами полости рта, кожи, дыхательных путей (носа), влагалища и кишечника у небеременных контролей. В совокупности профили плацентарного микробиома были наиболее схожи с микробиомом полости рта. Эти данные побудили авторов предположить, что бактерии распространяются гематогенным путем из ротовой полости матери в плаценту и колонизируют плод внутриутробно. Далее авторы обнаружили ассоциацию микробиома плаценты с отдаленным анамнезом антенатальной инфекции (такой как инфекция мочевыводящих путей в первом триместре), а также с преждевременными родами [1].

Эта работа послужила импульсом для череды работ, основным исследовательским вопросом которых было существование физиологической микробиоты плаценты. Краткое обобщение этих работ приведено в табл. 1. В большинстве первых работ ответ на вопрос «Существует ли микробиота плаценты?» был положительным [2–8, 10, 11, 42]. Помимо того, авторы исследовали различия в профилях плацентарного микробиома при различных перинатальных состояниях. Так, R. Doyle et al. (2014) обнаружили бактериальную ДНК в большинстве исследованных образцов плаценты независимо от способа родоразрешения, при этом в случаях недоношенной беременности наблюдали более высокую частоту выявления бактерий и их более широкий спектр, чем в случаях доношенной беременности [2]. К. Antony et al. (2015) показали, что среди женщин, перенесших преждевременные роды, избыточное увеличение массы тела во время беременности связано с измененным микробиомом плаценты и его метаболическим профилем [3]. Различные профили плацентарного микробиома были ассоциированы с низкой массой тела [4], а также с макросомией [11] новорожденного ребенка по сравнению с нормальной массой тела ребенка. J. Bassols et al. (2016) обнаружили различия в микробных профилях плацентарной микробиоты у женщин с гестационным сахарным диабетом и без него [5].

Таблица 1. Работы, посвященные изучению микробиома плаценты человека

Примечание. КС — кесарево сечение; ПР — преждевременные роды.

M. Collado et al. (2016) исследовали образцы плаценты, амниотической жидкости, молозива, мекония у новорожденных и кала у женщин у 15 пар мать–ребенок и выявили сходство микробных профилей мекония с микробными профилями плаценты, амниотической жидкости и молозива [6]. Результаты позволили авторам предположить, что кишечные микробы матери могут избирательно транспортироваться в молочную железу, плаценту и амниотическую жидкость, способствуя тем самым первоначальной внутриутробной колонизации кишечника плода.

Результаты исследования A. Prince et al. (2016) показали различия в микробных профилях плаценты при срочных и преждевременных родах, а также их варьирование в зависимости от наличия и тяжести хориоамнионита [7]. Связь определенных профилей плацентарной микробиоты с тяжелым хориоамнионитом, а также с более низкими длиной и массой тела новорожденного показана в работе R. Doyle et al. (2017) [8]. Помимо этого, результаты работы выявили большее сходство микробиоты плаценты с микробиотой влагалища, чем с микробиотой полости рта [8]. L. Gomez-Arango et al. (2017) в попытке выяснить происхождение микробиоты плаценты у беременных женщин с ожирением установили, что микробные профили плаценты имеют большее сходство с микробиотой полости рта, чем с микробиотой кишечника, хотя и обладают специфическими чертами [9]. L. Parnell et al. (2017) исследовали вопрос о вариациях в микробных профилях различных локусов плаценты и выявили различия в профилях амниона-хориона и базальной пластинки; относительно ворсин плаценты авторы предположили, что они не содержат резидентной микробиоты [10].

Таким образом, вышеприведенные исследования поставили под сомнение парадигму стерильной матки, предоставив свидетельства наличия бактерий в здоровой беременной матке. Сторонники концепции так называемого перинатального микробиома часто приводят результаты более ранних работ, проводившихся с использованием культурального метода. Так, небольшие количества Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis и Propionibacterium acnes выделялись из образцов пуповинной крови, полученной при плановом кесаревом сечении у здоровых новорожденных детей [43]. Эти данные были подтверждены в ходе эксперимента с мышами: беременным мышам орально вводили генетически меченые изоляты E. faecium от человека и впоследствии обнаруживали эти бактерии в амниотической жидкости [43]. Позднее эти же авторы проанализировали образцы мекония у здоровых новорожденных детей, рожденных либо вагинально, либо путем кесарева сечения, и выделили E. coli и бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium, Rothia, Bacteroides, Klebsiella, Enterobacter [44]. И снова оральное введение беременным мышам меченых E. faecium приводило к выявлению их в образцах мекония. Эти эксперименты позволили авторам предположить внутриутробный путь формирования микробиоты плода.

Сторонники теории физиологической микробной колонизации плаценты и плода предлагают несколько путей проникновения бактерий в плаценту, включая восхождение из нижних отделов репродуктивного тракта, проникновение через кровоток матери или активный перенос микроорганизмов иммунными клетками из кишечника или полости рта (см. рис. 1). В целом эти исследования свидетельствуют в пользу предположения, что фето-плацентарная среда развивалась, чтобы способствовать созданию разнообразной микробиоты, которая в дальнейшем играет роль в приобретении и формировании кишечной микробиоты новорожденного посредством внутриутробной передачи микроорганизмов [45].

Контаминация как причина обнаружения ДНК бактерий в плаценте и у плода: методологические аспекты изучения биологического материала с низкой микробной биомассой

Вскоре после первых публикаций, обосновывающих существование резидентной микробиоты плаценты, последовали работы, объясняющие выявление бактерий в образцах плаценты контаминацией [12–18]. Хорошо известно, что численность микроорганизмов в участках тела человека, достоверно обладающих резидентной микробиотой, таких как кишечник, ротовая полость или влагалище, огромна. В то же время результаты исследований микробиоты плаценты и амниотической жидкости, в которых оценивались ее количественные параметры, указывают на низкое содержание бактерий в данных сайтах [8, 10, 12, 14, 16, 17]. Сравнения бактериальной массы в образцах плаценты с бактериальной массой в образцах из ротовой полости, влагалища и отрицательных контрольных образцах [12] выявили различия в несколько порядков между плацентой, с одной стороны, и ротовой полостью и влагалищем, с другой, и отсутствие различий между плацентой и отрицательными контролями (рис. 2).

Рис. 2. Число копий гена 16S рРНК, определенное методом количественной ПЦР при анализе образцов плаценты, слюны, влагалища (полученных у 6 женщин) и отрицательных контролей. Адаптировано из: A. Lauder et al. [12]

Очевидно, что основным источником контаминации при вагинальных родах является микробиота родовых путей. Данная методологическая проблема может быть решена исследованием только образцов, полученных при кесаревом сечении, до установления родовой деятельности. Гораздо более трудноразрешимой проблемой при исследовании биологического материала с применением современных высокочувствительных технологий секвенирования ДНК является повсеместное присутствие микроорганизмов (в малых количествах) в лаборатории, в том числе китах для выделения ДНК, в связи с чем обнаружение бактерий в реагентах даже получило неформальное название «китом» [46, 47].

В нескольких работах сравнительный анализ последовательностей бактериальной ДНК, полученной из образцов плаценты и образцов окружающей среды, показал отсутствие значимых различий [12, 13, 15–18]. На рис. 3 представлены результаты анализа методом секвенирования гена 16S рРНК образцов плаценты, образцов слюны и ряда отрицательных контролей: контролей экстракции и контролей секвенирования (образцов, не содержащих клинического материала, которые анализируются так же, как клинические образцы, начиная со стадии экстракции и секвенирования ДНК соответственно), а также образцов воздуха в операционной. При этом для экстракции ДНК использовали два разных набора реагентов — MO BIO и PSP. Хорошо видно, что образцы плаценты имели бактериальные сообщества, не отличающиеся от бактериальных сообществ отрицательных контрольных образцов, при этом бактериальные сообщества плаценты и отрицательных контролей были специфичны для каждого набора: в наборе MO BIO доминировали представители Clostridiales, а в наборе PSP — представители Sediminibacterium и Bradyrhizobiaceae. В то же время образец слюны, обладающей высокой микробной биомассой, имел микробный состав, присущий ротовой полости и не зависящий от используемого набора для экстракции ДНК.

Рис. 3. Бактериальный состав образцов плаценты, слюны и отрицательных контролей, % от общего содержания бактерий. ДНК выделена с применением набора реагентов MO BIO (А), PSP (Б). Микробный состав образцов плаценты напоминает состав отрицательных контрольных образцов, тогда как в слюне выявляется микробиота, состав которой не зависит от набора для экстракции ДНК Адаптировано из: D. Kim et al. [47].

Наиболее убедительные доказательства того, что бактерии, выявляемые в плаценте, являются результатом контаминации, были получены в недавнем исследовании М. de Goffau et al. (2019), опубликованном в журнале Nature [18]. Были проанализированы образцы плаценты (в большинстве cлучаев полученные при кесаревом сечении до установления родовой деятельности) от 537 женщин с использованием культурального метода, количественной ПЦР в реальном времени и секвенирования, при этом секвенирование выполнялось с применением двух методов, а именно метода «дробовика» [48] и метода секвенирования гена 16S рРНК [49], чтобы принять в расчет потенциальное специфическое влияние каждого метода. Далее авторы использовали одни и те же процедуры для анализа биологического материала и всех отрицательных контролей. Результаты работы позволили сделать однозначное заключение: плацента во время здоровой беременности стерильна, и выявление бактерий убедительно объясняется контаминацией. Методологические детали, представленные в статье, показали, насколько вездесущими могут быть контаминирующие бактерии. Так, с помощью секвенирования в образцах плаценты были обнаружены два вида патогенных бактерий: Vibrio cholerae и Streptococcus pneumoniae. Сопоставление последовательностей этих бактерий, обнаруженных в плаценте, показало их идентичность последовательностям бактерий, которые ранее были выявлены в других клинических образцах и секвенированы на том же аппарате. Таким образом, обнаружение этих бактерий, скорее всего, являлось результатом загрязнения секвенатора [18]. Далее авторы подтвердили выводы предыдущих исследований, что в коммерческих наборах для экстракции ДНК присутствует относительно разнообразная микробиота, и, более того, идентифицировали сообщества бактерий, специфические для определенных китов.

Работа M. de Goffau et al. [18] определила пять различных моделей контаминации при исследовании образцов плаценты — контаминация:

• плаценты бактериями родовых путей в процессе родоразрешения;
• образцов биопсии во время их отмывания фосфатно-солевым буфером;
• ДНК в процессе ее экстракции;
• реагентов, используемых для амплификации ДНК перед секвенированием;
• реагентов или оборудования, используемых для секвенирования.

Интересно отметить, что единственным микроорганизмом в исследовании M. de Goffau et al. [18], продуцирующим «биологические», а не «контаминирующие» сигналы в плаценте, был Streptococcus agalactiae, который выявляли до установления родовой деятельности примерно у 5% женщин. S. agalactiae (или стрептококк группы В) — это перинатальный патоген, ассоциированный с тяжелыми (хотя и редкими) неонатальными инфекциями. Основным способом его передачи от матери ребенку считается интранатальный путь, тогда как трансплацентарная передача рассматривается как редкий способ. M. de Goffau et al. [18] не обнаружили связи между присутствием в плаценте S. agalactiae и преэклампсией, преждевременными родами и низкой массой тела плода. Тем не менее обнаружение S. agalactiae в плаценте каждой 20-й женщины может иметь важное значение для стратегий профилактики неонатальных стрептококковых инфекций, и этот вопрос заслуживает дальнейшего изучения.

Исследование M. de Goffau et al. [18] ясно продемонстрировало, что реальные биологические сигналы могут быть дифференцированы от контаминирующих сигналов, если:

• сигналы стабильно детектируются в биологических образцах с использованием разных методов экстракции и детекции ДНК;
• результаты не варьируют в зависимости от серии реагентов для анализа образцов;
• сигналы превышают минимальный порог детекции;
• сигналы полностью отсутствуют в отрицательных контролях или значительно менее выражены, чем в биологических образцах;
• выявленная ДНК принадлежит микроорганизму, присутствие которого в данном биологическом материале имеет биологический смысл (например, выявлен известный патоген).

Молекулярный анализ образцов органов и тканей, предположительно обладающих микробиотой с низкой биомассой, требует строгих методологических подходов к идентификации экзогенной ДНК и эффективной ее дифференциации от эндогенной ДНК, т.е. происходящей из изучаемого материала. Низкую микробную биомассу определяют как 10 копий гена 16S рРНК (эквивалентно 5–10 колониеобразующим единицам) в 1 мкл образца, тогда как высокую микробную биомассу — как 10⁵ копий и выше [50]. Включение адекватных технических контролей для выявления потенциальных источников контаминации ДНК при исследовании биологического материала с низкой микробной биомассой, таких как плацента, является абсолютно необходимым условием получения надежных результатов. В настоящее время предлагается ряд статистических и биоинформатических методов идентификации и отделения контаминирующих последовательностей ДНК [51]. Следует отметить, однако, что при высоком (> 50%) уровне контаминации все методы теряют способность надежно идентифицировать контаминирующие сиквенсы [52].

Работа M. de Goffau et al. [18] также внесла больше ясности в вопрос о возможных путях бактериальной колонизации плода. Содержание вагинальных бактерий в плаценте было ниже в пробах, полученных в ходе элективного, чем экстренного, кесарева сечения, что свидетельствует о восходящем или гематогенном распространении бактерий. Механические манипуляции в области гениталий во время вагинальных родов или операция кесарева сечения могут приводить к транзиторной бактериемии и гематогенному распространению бактерий [53]. Аналогично гематогенное распространение бактерий как результат транзиторной бактериемии может объяснять присутствие небольшого количества бактерий ротовой полости в плаценте или у плода. Такой способ распространения может приводить к колонизации плода непосредственно перед родами [53].

Заключение

Технологии высокопроизводительного секвенирования ДНК и развивающиеся параллельно с ними технологии биоинформатики без преувеличения открыли огромные возможности изучения микробиоты человека в различных участках его тела и при различных состояниях. Трудно представить себе другие методы, которые бы с такой полнотой раскрывали композицию микробного сообщества и долю каждого вида/группы микроорганизмов (в подавляющем большинстве бактерий) в этом сообществе. Необходимо помнить, однако, что с применением этих технологий мы выявляем бактериальную ДНК, а выявление ДНК само по себе не может считаться доказательством существования микробиома. Микробиом — это совокупность геномов микроорганизмов, и это понятие неотделимо от понятия микробиоты. Даже если бы удалось (или удастся в будущем) воспроизводимо продемонстрировать присутствие в плаценте биологических, а не контаминирующих последовательностей ДНК, далее потребовалась бы (или потребуется в будущем) демонстрация пролиферирующей способности и метаболической активности бактерий плаценты, потому что только так можно доказать существование жизнеспособного, функционирующего бактериального сообщества, которое имеет право называться микробиотой. Таким образом, вопрос о том, когда и как устанавливается симбиоз человека с его микробиотой, остается открытым, интригующим, фундаментальным, но на сегодняшний день доказательства того, что плацента является микробным резервуаром и источником первичной микробиоты человека, значительно проигрывают доказательствам обратного.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-115-50418.

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. Вся поисково-аналитическая работа и написание статьи были выполнены лично автором.

Выражение признательности. Рисунки, представленные в данном обзоре, заимствованы из статей, опубликованных издательством BioMed Central и распространяемых в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), разрешающей неограниченное использование, распространение и воспроизведение опубликованного материала, с указанием авторства.

About the authors

Elena V. Shipitsyna

Author for correspondence.
Email: shipitsyna@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-2309-3604
SPIN-code: 7660-7068
Scopus Author ID: 14071984800
ResearcherId: K-1271-2018

PhD in Biology

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Schematic representation of two opposing concepts of the formation of the primary human microbiota: A - the placenta and the fetus are sterile during a healthy pregnancy, and the intestinal microbiota of the child is formed during and after childbirth, while in the case of vaginal delivery, the microbiota of the newborn is similar to the microbiota of the mother's vagina, in the case of Caesarean section - with the microbiota of her skin; B - the microbiota of the fetus is formed in the womb, and its source is the microbiota of the placenta, which, in turn, comes from bacteria in the intestines or the mouth of the mother. Adapted from: M. Perez-Muñoz et al. [19].

Download (335KB)

Indexing metadata

3. Fig 2. The number of copies of the 16S rRNA gene, determined by quantitative PCR in the analysis of samples of placenta, saliva, vagina (obtained from 6 women) and negative controls. Adapted from: A. Lauder et al. [12]

Download (181KB)

Indexing metadata

4. Fig 3. Bacterial composition of samples of placenta, saliva and negative controls,% of the total content of bacteria. DNA was isolated using a set of reagents MO BIO (A), PSP (B). The microbial composition of the placenta samples resembles the composition of the negative control samples, while the microbiota is detected in the saliva, the composition of which does not depend on the DNA extraction kit Adapted from: D. Kim et al. [47].

Download (293KB)

Indexing metadata