Prospects for the Etiotropic Treatment of Dysferlinopathy

Full Text

Введение

Генная терапия — совокупность экспериментальных методов лечения, основанных на изменении генетического аппарата соматических клеток в целях исправления дефектов, вызванных мутациями в структуре ДНК. Появившись в начале 1970-х годов, генная терапия только недавно вышла на новый уровень в качестве разрешенной терапии некоторых наследственных заболеваний [1]. Проводимые исследования в этой области позволяют в ближайшее время ожидать существенное расширение перечня одобренных препаратов.

Мышечные дистрофии — одни из самых распространенных групп наследственных патологий [2]. Они связаны с мутациями в генах, кодирующих сарколеммные, саркомерные, ядерные структурные белки и ферменты. Мышечные дистрофии классифицируют по возрасту появления, типу наследования или по вовлеченности определенных групп мышц [3]. Среди миодистрофий выделяют поясно-конечностные мышечные дистрофии (ПКМД), для которых, как следует из названия, характерно преимущественное поражение мышц конечностей. ПКМД наследуются как по аутосомно-доминантному, так и по аутосомно-рецессивному типам наследования. В зависимости от затронутого мутацией белка различают дисферлинопатии, дистрофинопатии, кальпаинопатии [4]. Чаще всего, с частотой 1:30 000, встречается миодистрофия Дюшенна, которую вызывают нарушение функции или утрата белка дистрофина, кодируемого геном DMD в хромосоме Х. К более редким относятся, в частности, дисферлинопатии – группа мышечных дистрофий с распространенностью 1:200 000.

Дисферлинопатии

Дисферлинопатии — фенотипически гетерогенная группа нервно-мышечных заболеваний c аутосомно-рецессивным типом наследования, при которых происходит утрата или нарушение функции белка дисферлина в скелетной мышечной ткани, что обусловлено мутациями в гене DYSF (DYStrophy-associated Fer-1-like) [5].

К дисферлинопатиям относят миопатию Миоши, поясно-конечностную мышечную дистрофию типа 2Б (ПКМД типа 2Б), дистальную миопатию переднего ложа голени (ДМПЛГ), а также вторичные дисферлинопатии, возникающие вследствие развития кавеолино- и кальпаинопатий [6]. Помимо этих клинических фенотипов, существуют также так называемые проксимодистальные формы, некоторые формы гиперкреатинфосфокиназемии и псевдометаболические синдромы [7]. В клинический полиморфизм могут давать вклад гены-модификаторы [8], например ANXA1 и ANXA2, которые определяют тяжесть клинических проявлений дисферлинопатий [9]. В результате проведенных исследований было выявлено, что, поскольку их уровни экспрессии коррелируют с тяжестью заболевания независимо от клинической изменчивости фенотипа, эти гены могут считаться модификаторами лишь условно. Учитывая, что принципиальное различие в клиническом фенотипе между пациентами с миопатиями Миоши и ПКМД типа 2Б заключается в типе мышц, вовлеченных первоначально, обнаружение гена-модификатора может выявить механизм вовлечения мышц, характерный для специфических типов мышечной дистрофии. О наличии генов-модификаторов, влияющих на первичное поражение определенных групп мышц, на данный момент неизвестно. Считается, что ПКМД типа 2Б и миопатия Миоши являются аллельными формами гена с одной и той же мутацией, с чем связаны фенотипические различия [8, 10].

К основным клиническим проявлениям этих заболеваний относятся слабость и атрофия мышц, воспалительные процессы в мышечной ткани, встречаются такие симптомы, как кардиомиопатия. Тяжесть симптоматики сильно варьирует — от практически бессимптомного течения с изолированным увеличением креатинфосфокиназы в крови до тяжелых инвалидизирующих форм. В подавляющем большинстве случаев пациенты с данными патологиями интеллектуально сохранны. Далее рассмотрены клинические характеристики основных фенотипов дисферлинопатий.

Миопатия Миоши относится к дистальным миопатиям с типичными симптомами мышечной дистрофии. У большинства пациентов в детском возрасте нет мышечной слабости, и многие из них занимаются спортом. Симптомы обычно развиваются в возрасте от 15 до 30 лет. Пациенты замечают, что не могут ходить на цыпочках или подниматься по лестнице [11]. Возможно появление боли в икрах. Икроножные мышцы атрофируются, снижаются рефлексы растяжения мышц голеностопного сустава. Первичное вовлечение икроножных и подошвенных мышц считается клиническим признаком миопатии Миоши, отличающим ее от других дистальных мышечных дистрофий. Со временем мышечная слабость может распространяться на мышцы пояса нижних конечностей, однако в мышцах переднего отдела в конечном итоге также проявляется слабость.

На ранней стадии заболевания вовлечения мышц верхних конечностей обычно не происходит. По мере прогрессирования заболевания у пациентов может развиться слабость проксимального отдела ног и рук в различной степени. Слабость мышц сгибателей колена (подколенное сухожилие) может быть более выражена, чем разгибателей колена (четырехглавая мышца), что имеет значение для выбора места биопсии. Заболевание прогрессирует переменно, при этом некоторые пациенты остаются довольно стабильными с симптоматикой слабости дистальных отделов, в то время как у других может быть более агрессивное течение с участием проксимальных мышц.

В дебютной стадии сывороточные уровни креатинфосфокиназы, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и альдолазы значительно повышены. Характерным лабораторным признаком для миопатии Миоши является сильно повышенный уровень креатинфосфокиназы в сыворотке крови: от 20 до 150 раз выше нормы (обычно от 5000 до 20 000 МЕ/л при нормальном значении 200 Е/л). В некоторых случаях чрезвычайно высокий уровень креатинфосфокиназы обнаруживают во время рутинных анализов крови до развития клинических проявлений [12].

При биопсии атрофичной икроножной мышцы обычно обнаруживают обширный фиброз и жировое замещение с потерей большинства мышечных волокон. С другой стороны, при исследовании биоптата четырехглавой мышцы с менее выраженным симптомом слабости можно обнаружить только минимальные изменения (изменчивость размеров волокон, центральных ядер). Биопсия бессимптомной мышцы проксимального отдела руки также может быть относительно неинформативной. В биоптате мышцы подколенного сухожилия можно выявить промежуточные гистологические изменения с поразительной изменчивостью размера волокон и многочисленными некротическими и регенерирующими волокнами. Как дистрофин, так и дистрофин-ассоциированные белки нормально экспрессируются в мышечных волокнах [3].

Главное отличие ПКМД типа 2Б от миопатии Миоши — первичное поражение проксимальных групп мышц. Симптоматика проявляется в позднем подростковом возрасте и, как правило, медленно прогрессирует. Мышечная слабость преобладает в проксимальных мышцах бедер, мышцы плечевого пояса вовлекаются реже, а в некоторых случаях — гораздо позже. Вовлечение в процесс дистальных мышц ног может произойти спустя несколько лет прогрессирования. У некоторых больных начальное проявление ПКМД типа 2Б характеризуется одновременным вовлечением в процесс и дистальных, и проксимальных групп мышц нижних конечностей, что необходимо учитывать при диагностике [12].

Дистальная миопатия переднего ложа голени является достаточно редкой формой дисферлинопатии и дебютирует со слабости передней большеберцовой мышцы в возрасте от 14 до 30 лет. Заболевание стремительно прогрессирует с вовлечением проксимальной мускулатуры как нижних, так и верхних конечностей. Большинство пациентов утрачивают способность ходить через 10–20 лет от начала заболевания [13].

Впервые дистальная миопатия переднего ложа голени описана в 2001 г. в испанской семье с четырьмя больными родственниками. У всех пациентов в возрасте от 20 до 28 лет появилось изолированное поражение передних большеберцовых мышц с последующей слабостью в проксимальных мышцах нижней конечности. Были отмечены существенные атрофические изменения преимущественно в проксимальной мускулатуре, более выраженные в сгибателях колена и бедра, чем в разгибателях. Через 5–8 лет слабость распространилась на сгибатели запястья и пальцев, а также проксимальные мышцы верхних конечностей. Они потеряли способность ходить в возрасте от 31 до 50 лет. Уровень креатинфосфокиназы в сыворотке был повышен от 20 до 70 раз [14].

В целом клинические проявления дисферлинопатий очень вариабельны. У части пациентов происходит первичное поражение в дистальной мускулатуре. Например, в случае миопатии Миоши сначала поражаются икроножные и подошвенные мышцы, затем вовлекаются мышцы бедер и ягодиц. Также возможны случаи, когда проксимальное ослабление мускулатуры превалирует над дистальным, как в ПКМД: мышечная слабость и атрофические изменения начинаются в мышцах тазового и плечевого поясов. У пациентов в пределах одной семьи возможны поражения совершенно разных групп мышц [7, 15–17].

При изучении корреляций между генотипом и фенотипом у пациентов с недостатком дисферлина [27] было показано, что у 14 из 40 обследованных больных проявилась смешанная симптоматика, характерная как для мио-патии Миоши, так и для ПКМД типа 2Б. Еще у 10% пациентов был выявлен псевдометаболический синдром: зафиксированы болезненные отеки в дистальной части ног без симптомов атрофии и мышечной слабости, а у 5% больных — изолированная гиперкреатинфосфокиназемия без выраженных мышечных симптомов.

Дистрофические изменения преимущественно в мышцах тазового пояса свидетельствуют о ПКМД типа 2Б, в то время как атрофия мышц голеней указывает на мио-патию Миоши. При первичном обследовании пациента выявить патологические изменения в мышечной ткани позволяют КТ и МРТ. Атрофические изменения мышечных тканей голени часто предшествуют появлению клинических симптомов — поражение икроножных мышц с течением времени часто распространяется и на мышцы задней стороны бедра, задолго до того, как этот процесс приведет к выраженной клинической симптоматике. В редких случаях дистальной миопатии переднего ложа голени патологический процесс изначально визуализируется в передней большеберцовой мышце, однако с течением времени (как правило, за несколько лет) распространяется и на икроножную мышцу [19].

Некротический процесс в мышцах — один из патогистологических признаков дисферлинопатий. На ранней стадии заболевания тканевые изменения могут быть минимальны, характерны признаки регенерации — волокна с центрально расположенными ядрами. Исследование мышечной ткани у пациентов с дисферлинопатией на ультраструктурном уровне показало наличие в мембранах повреждений и накопление субсарколеммных везикул и вакуолей [20]. Также показано, что у пациентов с дисферлинопатией наблюдаются амилоидоподобные отложения и воспалительные инфильтраты, которые сходны с проявлениями классического полимиозита (аутоиммунного заболевания, характеризующегося диффузным воспалением мышц), однако отличаются с точки зрения цитологических и иммунологических показателей [21]. Ошибочное диагностирование полимиозита при ПКМД типа 2Б — распространенное явление. Эти два заболевания имеют некоторые общие симптомы, в том числе асимметричную слабость конечностей, повышенный уровень креатинфосфокиназы и электромиографические изменения, указывающие на повреждение мышц. Кроме того, результаты гистохимического исследования скелетных мышц свидетельствуют о различной степени миофиброза, некроза мышечных волокон и инфильтрации воспалительных клеток. Основным методом дифференциальной диагностики этих заболеваний является анализ экспрессии дисферлина в присарколеммном пространстве с помощью иммуногистохимического анализа или Вестерн-блота. Для пациентов с ПКМД типа 2Б результаты иммуногистохимического анализа или Вестерн-блота указывают на недостаток или отсутствие дисферлина в пораженном мышечном волокне и отрицательный результат или низкую экспрессию MHC-I, в то время как при полимиозите дисферлин сохраняет нормальное расположение [21]. ПКМД типа 2Б и полимиозит очень похожи клинически и, следовательно, при дополнительных исследованиях очень трудно различимы. Однако терапевтические схемы для этих заболеваний совершенно разные. Полимиозит является иммунологическим заболеванием и хорошо реагирует на гормональную и иммунодепрессивную терапию; таким образом, использование гормонов или иммунодепрессантов рекомендуется на ранней стадии для контроля прогрессирования заболевания [22]. Кроме того, некоторые исследования показали, что пациенты с ПКМД типа 2Б могут страдать от мышечной слабости после гормонотерапии, и было очень трудно восстановить мышечную силу после прекращения гормонального лечения, что указывало на то, что использование глюкокортикоидов может ухудшить состояние пациентов с ПКМД типа 2Б [23].

Для дисферлинопатий характерен высокий уровень креатинфосфокиназы в крови, как правило, превышающий норму в десятки раз (на ранних стадиях — 50–100 раз) и сохраняющийся на протяжении всего заболевания. Наряду со слабостью и атрофией дистальных мышц, значительное увеличение креатинфосфокиназы может являться признаком дисферлинопатии. По мере прогрессирования заболевания уровень креатинфосфокиназы и его диагностическая ценность снижаются [12].

Уровень дисферлина оценивают в биоптатах мышечной ткани больного, однако для этих целей можно использовать и CD14+ моноциты периферической крови, так как было показано, что DYSF в них также экспрессируется [24]. Эффективная мембранная регуляция необходима для ряда важных функций моноцитов/макрофагов, включающих рецептор-опосредованный фагоцитоз, секрецию цитокинов и рецепторов сигнальной регуляции посредством Rho семейства небольших GTP (например, Rac1, RhoA и Cdc42). Исследователи предполагают, что дефицит дисферлина может влиять на функцию моноцитов, учитывая участие дисферлина в мембранной регуляции в мышечных клетках и наличие дисферлина в моноцитах. Возможно, что нарушение функций макрофагов (предшественниками которых являются моноциты) может играть определенную роль в воспалительных реакциях, происходящих у многих пациентов с дисферлинопатией.

Внедрение в повседневную практику иммунологических методов анализа и методов молекулярной генетики существенно расширило возможности диагностики дисферлинопатий. Следует отметить, что для точной диагностики дисферлинопатии необходимо комбинированное применение различных методов.

Дисферлин

Дисферлин относится к семейству ферлин-1-подобных белков, в которую также входят отоферлин, миоферлин и др. Ферлин-1-подобные белки имеют гомологию с белком FER-1 нематоды Caenorhabditis elegans. У человека кодируется геном DYSF, расположенным на второй хромосоме в локусе 2p13.2. Ген содержит 55 экзонов, его длина в геноме составляет около 150 тыс. пар нуклеотидов, длина кодирующей последовательности — 6243 пары нуклеотидов. Белок дисферлин размером 237кДа представлен в широком диапазоне тканей, преимущественно экспрессируется в мышечных тканях, а также в кардиомиоцитах, моноцитах периферической крови [25] и в клетках префронтальной коры головного мозга, плаценты и костного мозга (по данным BioGPS). Дисферлин в организме присутствует в различных изоформах, но локализуется преимущественно в сарколемме, а также ассоциирован с цитоплазматическими везикулами.

Структура белка дисферлина схематично представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Структура белка дисферлина. Дисферлин состоит из семи последовательно соединенных С2-доменов с Ca2+-связывающей активностью, трех Fer-доменов, двух доменов DYSF, один из которых находится в другом, и трансмембранного домена T

 

Основной функцией дисферлина является его участие в репарации плазматической мембраны [28]. При повреждении мембраны внеклеточный кальций проникает в мышечные волокна, образуя зону с высоким содержанием кальция. Клеточные везикулы, содержащие дисферлин на поверхности своей мембраны, в месте образовавшегося повреждения и в присутствии повышенной концентрации кальция сливаются друг с другом и с плазматической мембраной, образуя своеобразную «заплатку» [29]. В этом процессе дисферлин играет свою роль на этапе слияния, облегчая везикулярный докинг и собственно слияние с плазматической мембраной, путем взаимодействия с другими молекулами дисферлина на мембране и везикулах, а также с аннексинами и некоторыми другими белок-связывающими партнерами. Известно, что к везикулам, которые связывает дисферлин в процессе репарации, также относятся лизосомы. Наконец была показана роль дисферлина в эндотелиальной клеточной адгезии и ангиогенезе [30]: было выяснено, что дисферлин участвует в восстановлении клеточной мембраны в мышцах и других клетках посредством слияния лизосом, этот механизм приводит к сборке мембранного патча. При репарации сарколеммы количество связанного с лизосомами мембранного белка (Lamp-1) уменьшается в сарколемме миоцитов у мышей с нокаутом гена дисферлина, что указывает на то, что экспрессия DYSF важна для процесса репарации, связанного с лизосомами. В клетках эндотелия коронарных артерий крупного рогатого скота дисферлин группируется в макродоменах мембранного патча после стимуляции Fas-лигандом (FasL), и сайленсинг гена дисферлина устраняет FasL-индуцированное нарушение эндотелий-зависимой вазодилатации в изолированных небольших коронарных артериях [30, 31]. Помимо этой основной функции, дисферлин может координировать ремоделирование цитоскелета через взаимодействие с компонентами фокальной адгезии. Дисферлин взаимодействует с β-парвином (аффиксином) — интегрин-связанным киназосвязывающим белком, который участвует в связи между интегрином и цитоскелетом, при этом он колокализуется с дисферлином в сарколемме нормальной скелетной мышцы человека. Показано, что С-конец дисферлина связывается с N-концевым доменом гомологии калпонина аффиксина и участвует в восстановлении клеточной мембраны [32]. Также известно, что в белковом комплексе с дисферлином присутствуют такие молекулы фокальной адгезии, как винкулин, актинин, талин и α-тубулин, которые также участвуют в процессе репарации сарколеммы, взаимодействуя с дисферлином [33]. Дисферлин может быть вовлечен в секрецию цитокинов и/или хемокинов [34, 35]. Дисферлин был связан с SNARE-опосредованными экзоцитотическими событиями, включая высвобождение цитокинов и секрецию кислой сфингомиелиназы. Установлено, что дисферлин стимулировал SNARE-опосредованное смешивание липидов с чувствительностью к кальцию: дисферлин ассоциируется с синтаксином 4 и SNAP-23, двумя повсеместно экспрессируемыми белками SNARE (Soluble NSF Attachment REceptor), ранее участвовавшими в экзоцитозе лизосом [36].

Поиск мутаций гена DYSF — сложная задача из-за большого размера гена и отсутствия мутационных «горячих точек». При миопатиях встречаются миссенс-мутации, короткие делеции и дупликации, распределенные по гену [15, 17–18, 20, 37]. Спектр мутаций детально разобран в работе M. Krahn et al. [38] и суммарно отражен в табл. 1.

 

Таблица 1. Спектр мутаций гена DYSF

Тип мутаций	Доля, %
Делеции и инсерции	24–30
Делеции	17–18
Вне рамки считывания	15–20
В пределах рамки считывания	1–3
Инсерции	7–12
Вне рамки считывания	7–12
В пределах рамки считывания	0
Точечные мутации	48–64
Миссенс-мутации	19–46
Нонсенс-мутации	18–29
Интронные мутации	11–23

 

 

Предполагают также наличие генетических или экологических факторов модификации, которые влияют на клиническую вариабельность данного заболевания [39].

Причины дисферлинопатий — мутации, приводящие к нарушению экспрессии гена DYSF и/или функции белка дисферлина. Основным способом подтверждения диагноза дисферлинопатии является поиск мутаций в гене. Однако на практике возникают сложности в обнаружении мутаций в гене DYSF из-за его большого размера и отсутствия участков гена, где чаще всего встречаются мутации [18, 40]. На сегодняшний день описано более 450 различных мутаций в гене, большинство из них являются однонуклеотидными заменами. Более 330 патогенных мутаций было идентифицировано в экзонах или вблизи экзон-интронных соединений [37]. Также есть сложности, связанные с определением компаунд-гетерозигот на молекулярном уровне. Нередко обнаруживается только одна из двух ожидаемых мутаций гена DYSF.

Подходы к терапии

На сегодняшний день активно разрабатывается и тестируется множество терапевтических методов. Существует несколько подходов, направленных на лечение дисферлинопатий, в частности такие, как иммуномодулирующая терапия, использование стволовых клеток, заместительная и лекарственная терапия, а также генотерапевтические методы [17, 26].

Иммунномодулирующая терапия включает использование препаратов, подавляющих воспаление, чтобы иммунный ответ пациента на дегенеративные процессы в мышцах не вызывал дополнительную гибель мышечных клеток. Эта стратегия используется, чтобы управлять воспалительной симптоматикой при мышечных дистрофиях, но все еще находится на стадии разработки для применения при дисферлинопатиях. На базе Jain Foundation проводят исследования с целью поиска возможных мишеней для иммуномодулирования дисферлинопатий. В качестве таких мишеней рассматривают ингибитор системы комплемента CD55 и цитокин IL-34, который способствует дифференцировке моноцитов и макрофагов через колониестимулирующий фактор-1 (по данным Jain Foundation Inc.).

Терапия стволовыми клетками включает доставку пациентам новых мышечных стволовых клеток, несущих нормальные копии гена DYSF, так что эти стволовые клетки дифференцируются в новые мышечные волокна, которые могут продуцировать функциональный белок дисферлин. Хотя считалось, что индуцированные стволовые клетки обладают ограниченной способностью к дифференцировке, т.е. они генерируют клетки из ткани, из которой они были получены. С конца 1990-х годов различные исследования показали, что при некоторых условиях стволовые клетки, полученные из ткани взрослого человека, проявляют так называемую пластичность. Y. Jiang et al. в 2002 г. получили из костного мозга мультипотентные взрослые прогениторные клетки (Multipotent Adult Progenitor Cells, MAPCs) [41]. Доктором M. Reyes было предложено использовать такие стволовые клетки в качестве клеточной терапии дисферлинопатий с исследованием лабораторных животных — мышей линии A/J. Группа исследователей охарактеризовала популяцию периваскулярных стволовых клеток из скелетных мышц, называемых мышечными MAPCs. Мышечные MAPCs, трансплантированные внутримышечно мышам mdx (мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна), показали значительный вклад в регенерацию мышц. Таким образом, MAPCs в качестве источника стволовых клеток могут имеют много преимуществ по сравнению с сателлитными клетками: их можно легко изолировать, они могут быть выращены in vitro в больших количествах, легко трансдуцированы, трансплантированы внутривенно и внутриартериально, обеспечивая широкое биораспределение, и, что наиболее важно, могут быть изолированы из аллогенных и аутологичных источников. Исследование применения MAPCs для терапии дисферлинопатий продолжается [42].

Существуют исследования, подтверждающие, что укороченный белок дистрофин с восстановленной рамкой считывания сохраняет свою функциональность. Подобные исследования, направленные на восстановление рамки считывания в гене DYSF, также показали, что укороченный дисферлин сохраняет функциональность. Таким образом, в качестве примера возможных методов генной терапии для лечения дисферлинопатий имеет смысл рассмотреть несколько современных методик, некоторые из них уже используются в терапии миодистрофии Дюшенна. Эта патология встречается чаще, чем дисферлинопатии, и на данный момент для нее уже разработаны различные методы терапии. Миодистрофия Дюшенна вызывается нарушением экспрессии гена DMD, кодирующего белок дистрофин и находящегося в хоромосоме X. В свою очередь, дистрофин локализуется на цитоплазматической поверхности сарколеммы и имеет своей основной функцией поддержание цитоскелета.

В генотерапевтических исследованиях существуют два основных подхода — in vivo и ex vivo. Генная терапия in vivo подразумевает редактирование генов или введение их нормальных копий непосредственно в организм, тогда как ex vivo — генетическую модификацию клеток в лаборатории с их последующей трансплантацией.

Учитывая, что миодистрофии, в частности дисферлинопатии, вызваны мутациями в генах, кодирующих белки, связанные с деятельностью мышечных клеток, на данный момент перспективным подходом является генная терапия, позволяющая корректировать генетический материал клетки (РНК или ДНК), так как она может позволить этиотропное лечение заболевания [43].

Прохождение стоп-кодона. В зависимости от характера мутации, вызвавшей генетическую патологию, и от предполагаемого результата терапии можно использовать различные методы манипуляции с геном. К ним относится, например, метод прохождения стоп-кодона [44, 45], который используют для восстановления рамки считывания. Некоторые антибиотики позволяют клетке игнорировать преждевременные стоп-мутации при синтезе белка, таким образом в результате синтезируется полноценный белок. Этот метод, к сожалению, показал достаточно низкую эффективность при терапии миодистрофии Дюшенна.

Пропуск экзонов. Большое количество патогенных мутаций в гене DYSF приводит к сдвигу рамки считывания. У некоторых пациентов с протяженными делециями DYSF наблюдается облегченная симптоматика дисферлинопатии, что позволяет предположить, что некоторые участки гена могут быть удалены без значительного влияния на функцию белка. На данный момент экзон-скиппинг с помощью антисмысловых олигонуклеотидов — один из передовых методов терапии мышечной дистрофии Дюшенна [46]. Примером терапии являются такие препараты, как Drisapersen компании GlaxoSmithKline, в настоящее время находящийся в третьей фазе клинических исследований, и Eteplirsen компании AVI BioPharma. Эти препараты нацелены на пропуск 51-го экзона гена дистрофина.

Было показано, что дисферлин с протяженной делецией может сохранять свою функциональность. В исследовании М. Krahn et al. описана больная с миопатией Миоши с гомозиготной делецией экзонов 2–40 гена DYSF. В возрасте 30 лет у нее наблюдали проксимальную слабость с трудностями при подъеме по лестнице и беге и повышенную концентрацию креатинфосфокиназы в сыворотке (от 2000 до 4000 МЕ/л; в норме — < 200 МЕ/л). При биопсии выявили умеренную дистрофическую картину: при нормальном размере мышечных волокон было отмечено большое количество центральных ядер. В возрасте 44 лет пациентка испытывала проблемы с ходьбой, но тем не менее не использовала трость. Таким образом, показано, что укороченный дисферлин функционирует и приводит к развитию относительно мягкого фенотипа миодистрофии с поздним началом [6].

Экзон-скиппинг. Этот метод предполагает пропуск экзона, в котором находится нонсенс-мутация, с помощью связывания антисмысловых олигонуклеотидов или использования системы CRISPR, благодаря чему синтезируется функциональный белок неполной длины. На данный момент известно, что этот метод используется в терапии миодистрофии Дюшенна. Используя антисмысловые олигонуклеотиды, также можно включить экзон в процесс сплайсинга, воздействуя ими на сайленсеры — короткие участки, ингибирующие сплайсинг пре-мРНК, если он был пропущен в результате мутации. Существуют исследования, согласно которым данный метод подходит и для дисферлинопатий. Например, доказано, что после пропуска экзона 32 белок дисферлин сохраняет свою функциональность [47], также было показано, что пропуск экзонов 26–27 и 28–29 позволяет получить функциональный дисферлин [27]. Исследования, направленные на анализ структуры белка дисферлина и определение возможных мишеней для терапевтического экзон-скиппинга, продолжаются [46].

Перманентный экзон-скиппинг с использованием технологии CRISPR — перспективный метод в современных доклинических исследованиях миодистрофии Дюшенна. В надежде добиться клинического успеха параллельно с миодистрофией Дюшенна пропуски экзонов и модуляция сплайсинга также изучаются при других мышечных дистрофиях, таких как ПКМД типа 2Б, дистальная миопатия переднего ложа голени, миотоническая дистрофия и мерозин-дефицитная врожденная мышечная дистрофия типа 1A (ВМД1A) [48].

Группа ученых изучала восстановление функции дисферлина после удаления экзона 32 в клетках пациентов [47]. Экзон-скипинг был осуществлен с помощью антисмысловых олигонуклеотидов в миобластах, взятых у пациентов с ПКМД типа 2Б и миопатией Миоши, имеющих мутации в экзоне 32 гена DYSF. Эффективность экзон-скипинга оценивали с помощью количественных тестов in vitro, отражающих восстановление мышечной ткани и мембран. В результате подтверждено, что функция дисферлина восполнена экспрессией усеченного дисферлина (белка, генерируемого после экзон-скиппинга) в исследуемых клетках. Было установлено, что укороченный дисферлин стабилен в модифицированных клетках пациентов. Молекулярная масса такого дисферлина (238 кДа) близка к полноразмерной изоформе, составляющей 241 кДа. Этот белок появляется уже через 48 ч после начала лечения. Была произведена оценка функции белка с помощью различных тестов. Совместная локализация с помеченным сарколеммным белком кавеолином-3 подтвердила мембранную локализацию укороченного дисферлина. В результате теста, связанного с восстановлением клеточных мембран после их повреждения бифотонным лазером, было показано, что благодаря терапии функция репарации мембран была восстановлена практически полностью. Результаты теста осмотического шока показали, что восстановление дисферлина с помощью лечения AON защищает клетки пациента от механического стресса.

В исследовании, посвященном мультиэкзон-скиппингу в гене DYSF, не только описан первый в истории успешный эксперимент по многократному пропуску экзонов в гене DYSF, но и идентифицированы две новые потенциальные мишени для экзон-скиппинга в целях терапии дисферлинопатий. Для эксперимента были созданы плазмидные конструкции, содержащие репортерную последовательность GFP и ген DYSF с исследуемыми делециями, которые были трансфицированы в клетки, взятые у пациентов с дисферлинопатией. Результаты исследования показали, что делеции экзонов DYSF 26–27 и 28–29 некритичны для репарации клеточной мембраны. Таким образом, эти экзоны можно считать многообещающими терапевтическими мишенями для экзон-скиппинга, тогда как экзоны 19–21, 20–21 и 46–48 необходимы для правильного регенеративного процесса, так что они не смогут стать перспективными целями для такого вида генной терапии. Затем исследователи разработали смеси антисмысловых морфолино-фосфородиамидатных олигомеров для пропуска экзонов 26—27 и 28—29 гена DYSF. Смеси были трансфицированы в клетки, взятые у пациентов с дисферлинопатией. Авторы показали экспрессию усеченных форм РНК и восстановление репаративной функции дисферлина в фибробластах пациентов с дисферлинопатией. Эти результаты показывают, что функциональное восстановление повреждений мембраны in vitro возможно посредством антисмыслового опосредованного экзон-скиппинга экзонов 28–29 гена DYSF с помощью смеси антисмысловых морфолино-фосфородиамидатных олигомеров, а также что антисмысловые морфолино-фосфородиамидатные олигомеры являются перспективными терапевтическими средствами для лечения пациентов с мутациями, которые находятся в экзонах 28–29 гена DYSF [27].

Экзон-скиппинг посредством АОН имеет некоторые недостатки. В качестве наиболее значимого можно выделить временный характер терапевтического эффекта. АОН — это короткие олигонуклеотиды, которые быстро разрушаются в клетке, поэтому их действие ограничено по времени и для постоянного поддержания эффекта необходимо их еженедельное введение. Также существенным недостатком можно считать высокую стоимость препаратов, например, терапия одного пациента на год этеплирсеном обходится в 892 000 долл. (по данным Institute for Clinical and Economic Review, 2019 г.). Кроме того, перед созданием препарата необходимо доказать, что в конкретной ситуации такой терапевтический подход возможен, т.е. что укороченный белок будет функционально активен.

Сплайсосомо-опосредованный транс-сплайсинг. Метод сплайсосомо-опосредованного транс-сплайсинга, также известный как SMaRT (spliceosome-mediated RNA trans-splicing), используют в разработке терапии муковисцидоза, гемофилии А, спинальной мышечной атрофии и некоторых других наследственных патологий, в том числе миодистрофии Дюшенна [49]. Транс-сплайсинг редко встречается в эукариотических клетках, и в исследовательских и терапевтических целях проводится индуцирование этого процесса при участии сплайсосомы. Транс-сплайсинг происходит, когда процесс сплайсинга идет на нескольких пре-мРНК, переходя с одной молекулы на другую. В результате такого процесса формируется зрелая мРНК с новым экзонным составом.

Данный метод позволяет корректировать мутации на уровне транскрипции, что приводит к восстановлению экспрессии нормального белка. Для того чтобы воспользоваться методом SMaRT, нужна олигонуклеотидная пре-транс-сплайсинговая молекула (ПТМ). Структурно она состоит из связывающего домена — комплементарного интрону участка, нужного для связывания с целевой пре-мРНК; сайта сплайсинга, нужного для инициации процесса, а также кодирующего домена — последовательности, которая будет внедрена в пре-мРНК и заменит собой ее целевой фрагмент [50]. Схематично процесс изображен на рис. 2.

 

Рис. 2. Основные направления SMaRT: А — 5’ транс-сплайсинг; Б — 3’ транс-сплайсинг; В — замена внутреннего экзона. Пре-транс-сплайсинговая молекула (ПТМ) комплементарно присоединяется к РНК-мишени и скрывает эндогенный сайт сплайсинга, одновременно предоставляя свой собственный сайт, который с помощью сплайсосомы предоставляет терапевтическую РНК-последовательность

 

С помощью этого метода проведено экспериментальное исследование с целью репарации мутаций мРНК β-глобина, вызывающих такие заболевания крови, как серповидно-клеточная анемия и β-талассемия. β-талассемия, известная также как болезнь Кули или средиземноморская анемия, связана с недостаточностью или полным отсутствием продукции цепей β-глобина. Генетически она обусловлена наличием мутаций в сайтах сплайсинга пре-мРНК, которые нарушают процесс созревания мРНК β-глобина. Использовав подход SMaRT, исследователям удалось восстановить около 5% мРНК β-глобина, ассоциированной с серповидно-клеточной анемией, и порядка 36% мРНК, ассоциированной с β-талассемией, и, хотя репарация прошла не полностью, результат может иметь терапевтический эффект [51].

В 2015 г. группа исследователей осуществила замену экзонов (31–55, 32–55, 36–55, 37–55) с помощью 3′ сплайсосомо-опосредованного транс-сплайсинга на миобластах от пациентов с диагностированной ПКМД типа 2Б, а также на мышиной модели: пре-транс-сплайсинговая молекула c последовательностью экзонов человеческого DYSF в ААВ-векторе инъецировали в передние большеберцовые мышцы четырехмесячных мышей линии Dysf-/-, и через 4 нед транс-сплайсированный транскрипт DYSF обнаружили во всех инъецированных мышцах. Секвенирование этих транскриптов подтвердило наличие неповрежденной химерной последовательности мышиного и человеческого DYSF с точной границей между последовательностями мыши и человека. С помощью флуоресцентного иммуноокрашивания на поперечных срезах мышц исследователи обнаружили в сарколемме устойчивую экспрессию дисферлина [52]. Следует отметить, что в результате данного исследования не было обнаружено неспецифичных продуктов транс-сплайсинга в экспериментальных образцах.

Перенос гена. Классическая генная терапия подразумевает внесение полного гена либо мини-гена в клетку для того, чтобы с этой матрицы синтезировался функцио-нальный белок.

Возможность переноса в клетку функционального гена дикого типа с целью восстановления функции белка является перспективным методом генной терапии мышечных дистрофий. Для создания генетических конструкций представляют интерес аденоассоциированные векторы (ААВ), способные доставлять ДНК как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, а также обеспечивающие достаточный уровень экспрессии трансгенов [27]. Однако у данной технологической платформы есть недостатки, требующие более тщательного изучения. В частности, аденоассоциированные векторы трансдуцируют мышечную ткань с низкой эффективностью, а их введение связано с возникновением гуморального иммунного ответа и формированием пула специфических антител [53]. Изучение макак-резусов (вида, который является естественным хозяином аденоассоциированных векторов), инфицированных аденоассоциированными векторами дикого типа, показало, что у всех животных, кроме инфицированных интраназальным путем, было обнаружено четырехкратное увеличение анти-ААВ-антител, т.е. развился гуморальный иммунный ответ на капсидные белки аденоассоциированных векторов [54]. Антитела против ААВ-2 были обнаружены в сыворотке и синовиальной жидкости у пациентов с заболеваниями суставов. Нейтрализующую активность в отношении ААВ определяли путем оценки способности жидкости или сыворотки ингибировать трансдукцию аденоассоциированных векторов хондроцитами in vitro. Синовиальная жидкость и сыворотка от всех пациентов ингибировали трансдукцию хондроцитов векторами ААВ [55]. Также в случае с мышечными дистрофиями недостатком аденоассоциированных векторов можно считать ограниченный размер трансгена (приблизительно 4700 пар нуклеотидов), что не позволяет использовать полный ген из-за большого размера кодирующей последовательности гена DYSF (6243 п.н.). Тем не менее метод двойного транс-сплайсинга позволяет обойти размерный лимит. Этот метод заключается в том, что кодирующую последовательность гена DYSF клонируют в виде двух отдельных частей в два аденоассоциированных вектора. В результате естественной способности аденоассоциированных векторов к конкатемеризации происходит объединение двух частей кДНК, что приводит к экспрессии полноразмерного белка дисферлина [56].

Внутримышечная инъекция дисферлин-дефицитных миобластов линии H2K, содержащих два рекомбинантных аденоассоциированных векторов, мышам линии A/J (модель с дисферлинопатией) привела к экспрессии полноразмерного дисферлина, продолжающейся по крайней мере в течение одного года, системные инъекции в хвостовую вену мышей этой конструкции привели к системной экспрессии белка [57]. Затем было проведено гистологическое исследование, которое показало, что трансплантированные мышам миобласты стимулируют регенеративный процесс. В результате гистологического исследования отмечены такие признаки, как большее количество вариантов размеров волокон, округлые миофибриллы, базофильные волокна и центральные ядра. В целом эти данные свидетельствуют о том, что в результате генной терапии удалось улучшить состояние мышечной ткани, и в целом о перспективности использования данной стратегии для лечения дисферлинопатий.

В 2010 г. было проведено исследование с использованием белка минидисферлина человека для восстановления повреждений сарколеммы в клетках модельных мышей с дисферлинопатией [6]. Ввиду большого размера гена DYSF прямой перенос кДНК целиком в клетки затруднен, поэтому использование мРНК минидисферлина, укороченной формы белка, обнаруженной у пациента с мягкой формой дисферлинопатии, рассматривается как альтернативная стратегия. Делеция экзонов 2–40 приводила к сдвигу рамки считывания и синтезу нефункционального белка. Однако биоинформационный анализ предполагаемых открытых рамок считывания в транскрипте с делецией выявил криптический кодон инициации трансляции, локализованный на 22 п.н. ниже нативного кодона инициации трансляции, который восстанавливал рамку в экзоне 41.

Альтернативная трансляция усеченного транскрипта из 1899 нуклеотидов приводит к получению минидисферлина весом 73 кДа. В нем сохраняется С-конец дисферлина (от 1471 до 2080), включая два последних домена С2 и N-концевой трансмембранный домен. Таким образом, работа продемонстрировала возможность обнаружения протяженных делеций гена DYSF при системном скрининге пациентов со слабым фенотипическим проявлением дисферлинопатии. К сожалению, несмотря на восстановление скорости репарации мембраны на мышиной модели в условиях in vitro, в условиях in vivo экспрессия мини-гена дисферлина в мышцах не привела к улучшению их состояния на гистологическом уровне, что может быть связано с тем, что способности к восстановлению мембраны недостаточно для восстановления всей функциональности дисферлина. Дополнительные домены C2, отсутствующие в этом мини-дисферлине, могут иметь значение в его полноценной функциональной роли [6].

Оверэкспрессия других генов. Существуют различные исследования, связанные c оверэкспрессией гомологичных дисферлину белков при его дефиците. Одним из таких исследований является анализ экспрессии миоферлина у пациентов с дисферлинопатией [58]. Миоферлин — новый белок с неизвестной функцией с высокой гомологией с дисферлином, предполагалось, что его экспрессия может компенсировать эффект от утраты дисферлина [59]. Чтобы проверить эту гипотезу, была исследована экспрессия миоферлина иммуноблотом и иммуногистохимическим анализом в мышцах пяти пациентов с дисферлинопатией. Иммуногистохимический и электронно-микроскопический анализ показали, что миоферлин и дисферлин расположены вдоль мембраны нормальных мышечных клеток. Несмотря на сохранение миоферлина в дисферлинопатических мышечных экстрактах белков, его распределение вдоль мембран существенно снижалось. В другом исследовании у четырех пациентов с ПКМД типа 2Б иммуноблот-анализ выявил повышенное содержание миоферлина, однако двое из них имели более тяжелое течение заболевание (один из них ходит только с поддержкой, а другой не может подняться по лестнице), в то время как двое других пострадали слабее (один из них может подняться по лестнице с посторонней помощью, у второго отмечается слабость только в нижних конечностях). Из чего авторы сделали вывод, что оверэкспрессия миоферлина не компенсирует отсутствие дисферлина в мышцах с дисферлинопатией. На данный момент известно, что компенсаторный процесс не решает проблему дефицита дисферлина и, как следствие, нарушения функции сарколеммальной репарации [60].

У трансгенных мышей с оверэкспрессией миоферлина проверяли гипотезу о том, что миоферлин, гомологичный дисферлину, может компенсировать отсутствие дисферлина [61]. При лазерном повреждении мембран мышечных клеток выявлено, что восстановление мембраны не является достаточным для коррекции дефицита дисферлина. В клетках с оверэкспрессией миоферлина не обнаружено клеточных аномалий in vitro. Однако оверэкспрессия миоферлина не корректирует репаративную функцию in vivo.

Заключение

На сегодняшний день существует множество патогенетических и симптоматических способов лечения наследственных мышечных дистрофий, тогда как этио-логических биоинженерных подходов, разрешенных к использованию, — буквально единицы. Наиболее распространена миодистрофия Дюшенна, соответственно, большинство разрабатываемых терапевтических методик направлено на лечение этой патологии. Нужно отметить, что более редкие нервно-мышечные наследственные патологии, такие как дисферлинопатии, также исследуются, но в меньшей степени. Известно, что некоторые терапевтические подходы, действенные в случае с миодистрофией Дюшенна, подходят и для лечения дисферлинопатий, в частности метод пропуска экзонов. Также интересен метод сплайсосомо-опосредованного транс-сплайсинга, который также имеет хороший потенциал в качестве подхода к терапии дисферлинопатий. Таким образом, экзон-скиппинг и транс-сплайсинг следует рассматривать как наиболее оптимальные подходы в терапии миодистрофий, в частности дисферлинопатий.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ «МГНЦ».

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. А.В. Иванова — сбор и обработка материала, написание и редактирование текста; С.А. Смирнихина — сбор и обработка материала, написание и редактирование текста; А.В. Лавров — сбор и обработка материала, написание и редактирование текста. Все авторы внесли существенный вклад в выполнение поисково-аналитической работы при написании обзорной статьи, прочли рукопись и одобрили ее направление на публикацию.

About the authors

Alisa V. Ivanova

Research Centre for Medical Genetics

Email: bioyoghurtneo@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8954-7330
SPIN-code: 9922-7412

Junior Researcher

Россия, 115478, Moscow, Moskvorechie, 1

Svetlana A. Smirnikhina

Research Centre for Medical Genetics

Email: smirnikhinas@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1558-3048
SPIN-code: 6884-6170

MD, PhD

Россия, 115478, Moscow, Moskvorechie, 1

Alexander V. Lavrov

Research Centre for Medical Genetics

Author for correspondence.
Email: alexandervlavrov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4962-6947
SPIN-code: 4926-8347

Leading Research Scientist, MD, PhD

Россия, 115478, Moscow, Moskvorechie, 1

References

Supplementary files