C-fos, ERK1/2, MAP2, NOTCH1 Proteins Expression Patterns in Human Cerebral Cortex Neurons after Ischemic Stroke

Full Text

Обоснование

При развитии ишемического инсульта (ИИ) головного мозга происходит перераспределение морфологических и функциональных связей между нейронами. От этого в большой мере зависит клиническое восстановление пациента [1]. Реализацию этого процесса обеспечивает ряд механизмов, которые могут быть инициированы различными стимулами или, напротив, отсутствием таковых [2–4]. Любая точка внутриклеточного сигнального пути в каждый момент времени может быть представлена как точка бифуркации сигнала в рамках «вилки возможностей»: обучение клетки (ее адаптация к изменившимся условиям микроокружения) или реализация процесса клеточной гибели при невозможности адаптации [5, 6]. Выявлен ряд ключевых этапов, по которым принято судить о состоянии поврежденной клетки. Так, этап активации синтеза ERK1/2 преимущественно связывают с механизмами, обеспечивающими адаптацию нейронов при воздействии на них повреждающих стимулов, дифференцировкой и спраутингом [7–9]. Известно, что ERK1/2 может индуцировать транскрипцию раннего гена c-Fos, которому отводят важную роль в синаптической пластичности, обеспечении процессов обучения и памяти [10]. Определение уровней протеинов c-Fos и ERK используют в качестве маркеров активации нейронов [11, 12]. На моделях локальной ишемии-реперфузии головного мозга у крыс показано, что экспрессия c-fos начинается сразу после начала периода реперфузии и регистрируется как в периинфарктной зоне, так и в удаленных от очага ишемии зонах мозга [13]. Ключевой позицией в оценке пластичности коры считается выявление локализации МАР2, которая влияет на процессы изменения структуры цитоскелета, регуляции транспорта веществ, необходимых для синаптической передачи сигналов. Есть данные об участии МАР2 в регуляции ею механизмов перестройки дендритов и шипикового аппарата [14]. Активация Notch1 сигнального пути играет важную роль в реализации процессов пространственного обучения, памяти, синаптической пластичности как в норме, так при физических нагрузках и после экспериментального травматического повреждения головного мозга у крыс. Это обеспечивается путем регуляции механизмов взаимодействия соседних зрелых клеток, а также определения направления дифференцировки прогениторных клеток [15, 16]. Учитывая клиническую актуальность поиска новых направлений патогенетически обоснованной терапии и реабилитации пациентов после ИИ, представляется актуальной цель настоящего исследования.

Цель исследования — изучить экспрессию белков с-fos, ERK1/2, MAP2, NOTCH1 в нейронах коры головного мозга человека после ишемического инсульта.

Методы

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одноцентровое одномоментное выборочное контролируемое нерандомизированное исследование.

Критерии соответствия

Включены пациенты с впервые случившимся ИИ в бассейне левой средней мозговой артерии, законные представители которых подписали форму информированного согласия на проведение патологоанатомического исследования. Критерии невключения: геморрагический характер нарушения мозгового кровообращения, повторный эпизод нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу, наличие черепно-мозговых травм, онкологических и аутоиммунных заболеваний в анамнезе, аллергических, воспалительных реакций, не связанных с ИИ на момент его развития.

Условия проведения

Материал получали из банка данных патологоанатомического отделения ГБУЗ ГКБ 36 им. Ф.И. Иноземцева в виде парафиновых блоков. Образцы головного мозга группы контроля (3 человека) также в виде парафиновых блоков получали из банка данных Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения города Москвы.

Продолжительность исследования

Запланированная продолжительность включения в исследование составила 1 год. Парафиновые блоки из банка данных патологоанатомического отделения ГБУЗ ГКБ 36 им. Ф.И. Иноземцева были получены в 2012 г., из банка данных Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения города Москвы — в 2017 г. Иммуногистохимическое исследование проведено в 2019 г.

Описание медицинского вмешательства

Выполнение настоящей работы не влияло на проведение патологоанатомического исследования, не предполагало вмешательства или изменения его протокола и заключалось в дополнительном гистологическом и иммуногистохимическом исследовании предоставленных из банка данных образцов ткани.

Исходы исследования

Основной исход исследования. Исследование не предполагало прижизненного медицинского вмешательства, как фактор воздействия рассматривается развившаяся у пациентов ишемия головного мозга. Цель исследования была достигнута при помощи оценки значений количественных показателей уровня экспрессии белков с-fos, ERK1/2, MAP2, NOTCH1 в нейронах коры головного мозга человека после ишемического инсульта. В качестве ключевого показателя, отражающего данные функции системы организма, было принято процентное содержание нейронов с положительной иммуногистохимической реакцией против вышеуказанных белков.

Дополнительные исходы исследования. У всех пациентов в зоне 3 присутствовала равнозначная и сопоставимая ткань, поэтому изменения в зонах 1 и 2 являются маркерами изучаемого ишемического воздействия, а не индивидуальными особенностями.

Методы регистрации исходов

Образцы тканей головного мозга фиксировали в 10%- м забуференном формалине. После отмывания фиксатора в проточной воде проводили стандартную гистологическую проводку образцов путем обезвоживания в этиловом спирте. Затем кусочки ткани пропитывали парафином и заливали в парафиновые блоки по стандартной методике [17–19]. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Германия) и растягивали на непокрытых предметных стеклах и стеклах с полилизиновым покрытием для иммунологических исследований Vision biosystems plus slides (Великобритания). Затем адгезировали при +56 °С в течение 30 мин. Полученные срезы депарафинизировали, окрашивали гематоксилином и эозином по Нисслю, дегидратировали и просветляли в ксилоле (Microm HMS 70). Срезы заключали под покровные стекла в синтетической монтирующей среде (Shandon-Mount). Срезы на покрытых поли-L-лизином стеклах подготавливали к иммуногистохимическому и иммунофлуоресцентному окрашиванию, для этого сначала проводили депарафинизацию, затем — демаскировку антигена в Tris-EDTA pH 10.0 буфере в микроволновой печи при мощности 100 W в течение 10 мин, охлаждали до комнатной температуры, отмывали в PBS.

Выявление таргетных белков NSE, с-fos, ERK1/2, MAP2, NOTCH1 проводили непрямым иммунопероксидазным иммуногистохимическим методом. Для иммунофенотипирования использовали моноклональные антитела к указанным белкам человека (Vision biosystems novocastra, Великобритания), а также пероксидазную детекционную систему Peroxidase Detection System for Novocastra (Leica Microsystems, Германия), включающую вторичные универсальные биотинилированные антитела и стрептавидин-пероксидазный комплекс. Визуализация реакции осуществлялась DAB-хромогеном. Иммуногистохимические реакции проводили согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам. При завершении окрашивания выполняли фоновое контрастирование срезов гематоксилином Майера. В качестве отрицательного контроля вторичных антител не добавляли первичные антитела. Контроль специфичности реакции проводили с помощью неиммунной сыворотки, а также антител к виментину (Dako, Дания).

Полученные гистологические и иммуногистохимические препараты изучали с помощью светового микроскопа Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием цифровой фотокамеры Canon PowerShot, программного обеспечения AxioVision LE (Carl Zeiss, Германия), а также флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TE-2000. Визуальную оценку и морфометрический анализ срезов проводили на полученных с использованием вышеуказанного оборудования (объектив × 40, апертура 0,9) цифровых фотографиях коры головного мозга размером изображения 1300 × 1030 пикселов, реальным размером 220 × 174 мкм (38 280 мкм²) семи неперекрывающихся полей зрения в каждой из трех зон (1 — зоны, прилежащей непосредственно к очагу некротической ткани; 2 — зоны, отдаленной от предыдущей на 4–7 см; 3 — зоны контралатерального полушария, симметричной очагу ИИ) на каждом из трех последовательных срезов мозга человека из группы исследования (n = 189 полей зрения для каждой зоны) и семи полей зрения каждого из трех срезов в группе контроля (3 человека, 63 поля зрения) [20, 21]. Морфометрическое исследование включало определение: общей численной плотности (абсолютное количество изучаемых элементов на единицу площади среза) нейронов (NSE-позитивных клеток) на 1 мкм²; общей численной плотности морфологически измененных, потенциально нефункциональных нейронов на единицу площади 1 мкм²; процентного содержания морфологически измененных нейронов от их общего числа; общей численной плотности клеточных элементов на 1 мкм² (окрашивание гематоксилином-эозином по Нисслю); процентного содержания нейронов с положительной иммуногистохимической реакцией против вышеуказанных белков.

Этическая экспертиза

Исследование в рамках диссертационной работы «Закономерности изменения механизмов регуляции апоптоза нейронов в остром периоде ишемического инсульта» одобрено Межвузовским комитетом по этике, выписка из протокола заседания от 26.09.2019 № 08-19.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки. Расчет размера выборки проводился на этапе планирования исследования, уровень значимости для отклонения нулевой гипотезы был задан 0,05; мощность — 80%. Для группы исследования n = 189 полей зрения для каждой зоны (что соответствовало семи неперекрывающимся полям зрения каждого из трех срезов в каждой из трех зон у каждого из 9 человек группы исследования); для группы контроля n = 63 (семь полей зрения каждого из трех срезов у каждого из 3 человек).

Методы статистического анализа данных. 1. Для анализа подсчета клеток различного типа использовалась пакетная обработка фотографий срезов в приложении ImageJ. Последующая статистическая обработка полученных данных выполнена в ПК Statistica 6.0. 2. Выборки представлены в виде медианы (1-й квартиль, 3-й квартиль). 3. Для сравнения выборок использовали непараметрические критерии статистического анализа — критерий Манна–Уитни, для расчета корреляции — непараметрический коэффициент корреляции Спирмена.

Результаты

Объекты (участники) исследования

Материалом для патоморфологического исследования были образцы ткани головного мозга (поля 1–8 по Бродману) 9 пациентов, умерших в стационаре в срок от 2 до 6 сут после развития ИИ в бассейне левой средней мозговой артерии. Контрольные образцы были получены от людей, погибших в результате несчастного случая (3 человека). Исследовали кору головного мозга из трех зон (рис. 1): 1 — зоны, прилежащей непосредственно к очагу некротической ткани; 2 — зоны, отдаленной от предыдущей на 4–7 см; 3 — зоны контралатерального полушария, симметричной очагу ИИ (см. рис. 1). В группе контроля исследовали один образец ткани коры головного мозга поля 1–8 по Бродману. Анализировали семь случайных неперекрывающихся полей зрения в каждой из трех зон (n = 189 полей зрения для каждой зоны) на трех отдельных срезах у каждого из 9 человек группы исследования и семи полей зрения в каждом из трех срезов у каждого из 3 человек группы контроля (n = 63).

 

Рис. 1. Схематичное изображение исследованных зон коры головного мозга

 

Основные результаты исследования

Общая численная плотность нейронов (NSE-позитивных клеток) во всех исследуемых зонах достоверно отличалась от группы контроля, в которой она составила 1489 (1436,8; 1567,4) единиц на 1 мкм² (ед./мкм²). Так, в зоне 1 она составила 418 (339,6; 496,3) ед./мкм², в зоне 2 — 835,9 (783,7; 940,4) ед./мкм², в зоне 3 — 1097,2 (1018,8; 1201,7) ед./мкм² (р < 0,01 для всех зон). При этом прослеживалась достоверная динамика увеличения общей численной плотности нейронов при удалении от ишемического очага (р < 0,01). Наибольшее процентное содержание поврежденных нейронов отмечалось в зоне 1 (92,9 (88,9; 95,5)%), далее оно уменьшалось по мере удаления от очага и в зоне 2 составило 75 (71,4; 78,6)%, а в зоне 3 — 15 (10,3; 19,5)%. В контрольных образцах оно было наименьшим (10,3 (6,7; 13,5)%) и достоверно отличалось от всех зон исследования (р < 0,01). При этом общая численная плотность поврежденных нейронов была наибольшей в зоне 2 и достигала 627 (574,7; 705,3) ед./ мкм², тогда как в зоне 1 — лишь 391,8 (339,6; 470,2) ед./мкм². Это можно объяснить тем, что в зоне 1 общее количество нейронов на единицу площади было значительно снижено, поэтому, хотя поврежденные нейроны значимо преобладали в этой зоне, количественный показатель был достоверно меньшим (р < 0,01). В зоне 3 и контрольных образцах также наблюдались значимые (р < 0,05) отличия по данным показателям (156,7 (104,5; 209) ед./мкм² и 13,9 (9,8; 18,6)% соответственно для общей численной плотности и для доли поврежденных нейронов).

Общая численная плотность клеточных элементов на единицу площади была наибольшей в зоне 1 и составляла 1462,9 (1175,5; 1724,1) ед./мкм², это происходило за счет лейкоцитарной инфильтрации. В других зонах лейкоцитарной инфильтрации не наблюдалось, там показатели были равны 1306,2 (1149,4; 1462,9) и 1724,1 (1593,5; 1880,9) ед./мкм² соответственно для зон 2 и 3, что достоверно отличалось (р < 0,01) от группы контроля (2298,9 (2089,9; 2534) ед./мкм²).

Доля экспрессирующих белок с-fos нейронов была наибольшей в зоне 2 (36,4 (31,3; 42,4)%), что достоверно отличалось как от группы контроля (18,8 (15,3; 23,8)%), так и от показателей других зон (27,8 (20; 33,3)% и 32,6 (28,2; 38,1)% соответственно для зон 1 и 3) (р < 0,01) (рис. 2).

 

Рис. 2. Нейроны, экспрессирующие белок с-fos

 

Показатели экспрессии ERK1/2 и MAP2 в NSE-позитивных клетках имели схожие паттерны и достоверно отличались от группы контроля (соответственно 75 (69; 78)% и 86,7 (78; 92,5)%) только в образцах зоны 1 (57,1 (52,9; 61,5)% и 76,9 (68,8; 82,4)%). При этом для зон 1 и 2 были выявлены достоверные положительные корреляционные связи между долей ERK1/2 и с-fos-позитивных нейронов (для зон 1 и 2 r = 0,277 и r = 0,211 соответственно, р < 0,01) (рис. 3, 4).

 

Рис. 3. Нейроны, экспрессирующие белок ERK1/2

 

Рис. 4. Нейроны, экспрессирующие белок MAP-2

 

Наибольшая представленность NOTCH1-позитивных нейронов отмечалась в зоне 1 и составляла 42,1 (36,4; 46,7)%, далее их доля достоверно снижалась (р < 0,01) по мере удаления рассматриваемого образца от очага ишемии до 38,5 (34,4; 43,2)% в зоне 2 и до 33,3 (28,2; 39,5)% в зоне 3. Во всех исследованных зонах отличия от контрольного образца (30,8 (25,4; 35,8)%) были достоверными (р < 0,01) (рис. 5).

 

Рис. 5. Нейроны, экспрессирующие белок NOTCH1

 

Учитывая, что в общей выборке по критерию летального исхода присутствовали пациенты, умершие как на 1-е сут после поступления в стационар, так и к 6-м сут исследования, был проведен сравнительный анализ между этими подвыборками. Достоверные различия обнаружены лишь по четырем из всех исследованных параметров. Так, были выявлены достоверные различия общей численной плотности поврежденных нейронов во всех зонах исследования. Для зоны 1 значения общей численной плотности поврежденных нейронов составили 444,1 (313,5; 496,3) ед./мкм² и 365,7 (313,5; 444,1) ед./мкм², соответственно для летальных исходов на 1-е и к 7-м сут исследования; в зоне 2 — 679,2 (627; 731,5) ед./ мкм² и 600,8 (548,6; 705,3); в зоне 3 — 156,7 (130,6; 235,1) и 130,6 (78,4; 182,9) ед./мкм². Из этих данных видно, что с течением времени от момента развития сосудистой катастрофы количество поврежденных нейронов в коре головного мозга снижалось. Это происходило на фоне отсутствия достоверных отличий в общей численной плотности нейронов, что можно объяснить либо их восстановлением, либо замещением. Значения доли поврежденных нейронов как расчетного показателя отношения общей численной плотности поврежденных нейронов к общей численной плотности нейронов полностью повторяли паттерны различий первой и были равны для зоны 1 — 100 (94,4; 100)% и 86,7 (81,8; 90,5)%, для зоны 2 — 78,1 (75; 83,3)% и 71,85 (67,6; 75)% и для зоны 3 — 16 (12,5; 22,5)% и 12,65 (7,9; 17,1)%. Общая численная плотность клеточных элементов имела различия в образцах коры головного мозга пациентов с летальным исходом на 1-е и к 7-м сут исследования только в зоне 2, где она увеличивалась с течением времени с 1253,9 (1123,3; 1358,4) до 1332,3 (1175,5; 1515,2) ед./мкм² (р < 0,01). При проведении корреляционного анализа получены достоверные зависимости между следующими параметрами: доли c-fos- и ERK1/2-позитивных нейронов (r = 0,277 и r = 0,211, p < 0,01 для зон 1 и 2 соответственно), доли ERK1/2-позитивных нейронов и ОЧП поврежденных нейронов в контроле (r = –0,289; p < 0,05), доли NOTCH1- и MAP2-позитивных нейронов в контроле (r = 0,260; p < 0,05).

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Для острейшего периода ИИ характерно увеличение общей численной плотности и уменьшение доли поврежденных нейронов при удалении от ишемического очага, что сопровождается наибольшей долей с-fos протеин-позитивных нейронов в зоне 2, наибольшей представленностью NOTCH1-позитивных нейронов в зоне 1, меньшими долями ERK1/2- и MAP2-позитивных нейронов по сравнению с контрольными только в образцах зоны 1.

Обсуждение основного результата исследования

Для острейшего периода ИИ характерно увеличение общей численной плотности и уменьшение доли поврежденных нейронов при удалении от ишемического очага. При этом значения в образцах контралатерального очагу полушария достоверно отличаются от значений контрольных образцов. То есть при развитии локального ишемического повреждения изменения затрагивают весь головной мозг. Это связано с особенностями функционирования многоуровневых нейронных сетей: для обеспечения одной функции активируются нейроны, расположенные в разных участках головного мозга [1]. При повреждении какого-либо элемента вся сеть перестраивается либо деградирует, что сопровождается локальной активацией либо инициацией механизмов клеточной гибели [22]. Для активации и адаптивной перестройки нейрона под действием внешнего стимула требуется достаточное энергообеспечение [23], в противном случае инициированный сигнальный путь может изменить направление и привести клетку к гибели [24]. Так, в зоне 1 в условиях максимального по сравнению с зонами 2 и 3 субстратного дефицита и гипоксии наблюдались максимальные потери нейронов. При этом здесь выявлена минимальная доля c-fos-позитивных нейронов. Хотя экспрессия этого белка инициируется при изменении микроокружения нейрона [25], при столь выраженном дефиците энергии и субстратов она ведет, как мы предполагаем, не к адаптивной перестройке системы, а к ее гибели [26]. Таким образом, для зоны 1 характерны повышенная ригидность и выраженное снижение диапазона адаптационного ответа ткани: любой внешний стимул с наибольшей вероятностью приводит клетку к реализации механизмов клеточной гибели. На уровне цитоархитектоники это выражается снижением клеточной плотности, отсутствием дифференциации на слои, а также значительным преобладанием поврежденных клеточных элементов. Наибольшая по сравнению с другими зонами доля NOTCH1-позитивных нейронов в зоне 1, вероятно, связана с ролью Notch1-сигнального пути в регуляции межклеточных взаимодействий [16]. Возможно, увеличение его экспрессии в зоне 1 связано с максимально выраженной потерей межклеточных нейрон-нейрональных и нейрон-астроглиальных взаимодействий и «автоматическим включением» системы их восстановления — попыткой, которая в условиях энергодефицита и ригидности системы ведет к ее гибели. Для зоны 1 также отмечена достоверная корреляционная связь между долями c-fos- и ERK1/2-позитивных нейронов. Этот результат соответствует экспериментальным данным других исследователей, которые показали возможность индукции ERK1/2-транскрипции раннего гена c-Fos [10]. Известно, что с-Fos и ERK используют в качестве маркеров активации нейронов [11, 12], однако, вероятно, в условиях суженного адаптационного диапазона зоны 1 она может быть реализована клеточной гибелью. Вероятно, этим можно объяснить и сниженные в этой зоне (по сравнению с контрольными образцами и другими зонами) доли с-Fos- и ERK1/2-позитивных нейронов. Исходя из вышесказанного, объяснимым фактом является и минимальная доля МАР2-позитивных нейронов в зоне 1. Для накопления в нейроне МАР2, оказывающего влияние на структуру цитоскелета, регуляцию транспорта веществ, необходимых для синаптической передачи сигналов, обеспечивающего перестройку дендритов и шипикового аппарата [14], необходима нейромедиаторная и электросинаптическая стимуляция нейрона. Эти процессы должны быть обеспечены энергией, субстратами, целостностью участка нейронной сети, чего нет в периишемической зоне пенумбры. Зона 2 отличалась наибольшей долей с-fos протеин-позитивных нейронов. Как и в зоне 1, этот показатель достоверно коррелировал с долей ERK1/2-позитивных нейронов, что свидетельствует об инициированной повреждением активации [11]. Учитывая, что общая численная плотность нейронов здесь была на порядок больше, чем в зоне 1, и приближалась по значениям к зоне 3, а также значительно увеличивалась доля морфологически сохранных и MAP2-позитивных нейронов, можно сделать вывод о состоянии повышенной лабильности и расширенного адаптационного диапазона именно этого участка коры. Представленность NOTCH1-позитивных нейронов здесь была выше, чем в контрольных образцах и зоне 3, что может свидетельствовать об инициации потенцирования межклеточной коммуникации. Показатели экспрессии ERK1/2 достоверно не отличались от группы контроля, но при этом как в зоне 3, так и в контроле не выявлено корреляции между долями ERK1/2- и с-fos-позитивных нейронов. Это позволяет предложить использование указанного критерия для отличия между активацией ткани мозга непосредственно поврежденной и опосредованной активацией интактной ткани. Следовательно, можно заключить, что зона 2 — это зона расширенного адаптационного диапазона, обладающего повышенной лабильностью нервной ткани. Ее элементы, по нашему мнению, более чувствительны к внешним стимулам, нежели в интактной ткани, и обладают расширенным диапазоном ответа. Это обеспечивает, с одной стороны, интенсивное формирование новых межнейронных и нейроглиальных взаимодействий, но с другой — в любой момент при незначительном колебании метаболического обеспечения переключение на реализацию апоптозиндуцирующих клеточных каскадов. Зона 3, по нашему мнению, является зоной повышенной активации интактной ткани. Однако, учитывая ее иммуногистохимические характеристики, ее лабильность ниже, чем таковая зоны 2. Достоверные отличия изученных показателей этой зоны от контрольных образцов, на наш взгляд, можно объяснить не повреждающим эффектом ишемии (так как зона ишемии локальна и находится в противоположном полушарии: в зоне 3 уровень субстратного и энергообеспечения не уменьшался ниже критических величин), а адаптивными процессами, направленными на формирование новых нейронных сетей, которые будут обеспечивать восполнение или замещение утраченной в результате ИИ функции пациента.

Ограничения исследования

Все пациенты, чьи образцы ткани головного мозга были взяты из соответствующих банков данных, получали объем медицинской помощи в соответствии со стандартом медицинской помощи больным с инсультом (при оказании специализированной помощи), что не учитывалось при исследовании. Также не учитывались факт, продолжительность и характеристики интенсивной терапии.

Заключение

Ранее проведенные исследования показывают, что экспрессия ERK1/2, сопряженная с экспрессией c- fos, может быть использована в качестве маркера активации нейронов на моделях локальной ишемии-реперфузии головного мозга у крыс. Активация Notch1-сигнального пути свидетельствует об интенсивности поиска межклеточного взаимодействия, а МАР2, оказывая влияние на структуру цитоскелета, регуляцию транспорта веществ, обеспечение синаптической передачи, — о его реализации. При развитии локального ишемического повреждения изменения указанных параметров затрагивают весь головной мозг. Контралатеральное очагу полушарие является зоной повышенной активации интактной ткани, тогда как участки коры, прилежащие непосредственно к очагу (зона 1) и отдаленные от него (зона 2), имеют признаки патологической активации. При этом для зоны 1 характерна повышенная ригидность (снижение диапазона адаптационного ответа ткани), а для зоны 2 — повышенная лабильность (расширение адаптационного диапазона). Поэтому ключевой мишенью для терапевтического воздействия является зона 2.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование и публикация статьи осуществлены на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. С.П. Сергеева — поисково-аналитическая работа, построение дизайна, координирование исследования, работа с пациентами, исследование гистологичеких препаратов, оформление сопутствующей документации, написание статьи; А.В. Люндуп — поисково-аналитическая работа, координирование исследования, обеспечение лабораторной базы исследования; В.В. Береговых — поисково-аналитическая работа, редактирование текста, научное консультирование; А.А. Савин — обеспечение клинической базы исследования, консультирование по клиническим аспектам исследования, поисково-аналитическая работа; П.Ф. Литвицкий — консультирование по патофизиологическим аспектам исследования, построение дизайна, поисково-аналитическая работа, редактирование статьи; Л.Р. Горбачева — поисково-аналитическая работа, консультирование по морфологическим аспектам, редактирование; Е.В. Киселева — выполнение иммуногистохимического исследования; И.Д. Бреславич — статистическая обработка, формулирование концепции; К.И. Куценко — обеспечение патоморфологической базы исследования, работа с банком данным; Л.В. Шишкина — обеспечение лабораторной базы исследования, научное консультирование в чтении гистологических препаратов.

About the authors

Svetlana P. Sergeeva

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: svetlanapalna@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0083-1213
SPIN-code: 4257-9498

MD, PhD

Россия, 8, bld. 2, Trubetskaya str., 119991, Moscow

Aleksey V. Lyundup

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: lyundup@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0102-5491
SPIN-code: 4954-3004

MD, PhD

Россия, Moscow

Valery V. Beregovykh

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: beregovykh@ramn.ru
ORCID iD: 0000-0002-0210-4570
SPIN-code: 5940-7554

MD, PhD, Professor, Aсademiсian of the RAS

Россия, Moscow

Petr F. Litvitskiy

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: litvicki@mma.ru
ORCID iD: 0000-0003-0151-9114
SPIN-code: 6657-5937

MD, PhD, Professor, Corresponding Member of the RAS

Россия, Moscow

Aleksey A. Savin

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: lasavin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6340-8623
SPIN-code: 9162-6720

MD, PhD, Professor

Россия, Moscow

Liubov R. Gorbacheva

Lomonosov Moscow State University

Email: gorbacheva@mail.bio.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-3910-8831
SPIN-code: 4394-0575

PhD, Professor

Россия, Moscow

Ekaterina V. Kiseleva

Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences

Email: evkiseleva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2270-6595
SPIN-code: 7421-8496

PhD

Россия, Moscow

Ilya D. Breslavich

Lomonosov Moscow State University

Email: br_i@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-9321-9102
SPIN-code: 9615-9237

ассистент

Россия, Moscow

Kirill I. Kutsenko

Bureau of Forensic Medicine of Moscow Healthcare Department; International Legal Institute

Email: ceamler@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9299-5153
SPIN-code: 8964-3717

MD, PhD

Россия, Moscow

Lyudmila V. Shishkina

N.N. Burdenko Scientific Research Neurosurgery

Email: lshishkina@nsi.ru
ORCID iD: 0000-0001-7045-7223
SPIN-code: 6341-2050

MD, PhD

Россия, Moscow

References

Supplementary files