Vitamin D-binding protein: multifunctional component of blood serum

Alexandra A. Povaliaeva; Поваляева Александра Александровна; Ekaterina A. Pigarova; Пигарова Екатерина Александровна; Anastasia A. Romanova; Романова Анастасия Александровна; Larisa K. Dzeranova; Дзеранова Лариса Константиновна; Artem Y. Zhukov; Жуков Артем Юрьевич; Liudmila Y. Rozhinskaya; Рожинская Людмила Яковлевна

doi:10.15690/vramn1396

Витамин D-связывающий белок как многофункциональный компонент сыворотки крови

Авторы: Поваляева А.А.¹, Пигарова Е.А.¹, Романова А.А.¹, Дзеранова Л.К.¹, Жуков А.Ю.¹, Рожинская Л.Я.¹
Учреждения:
1. Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии
Выпуск: Том 76, № 1 (2021)
Страницы: 103-110
Раздел: АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ЭНДОКРИНОЛОГИИ
Дата публикации: 12.04.2021
URL: https://vestnikramn.spr-journal.ru/jour/article/view/1396
DOI: https://doi.org/10.15690/vramn1396
ID: 1396

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Витамин D-связывающий белок (DBP) был открыт более полувека назад в качестве полиморфного белка сыворотки крови и к настоящему моменту характеризуется многообразием физиологических свойств. Прежде всего, DBP переносит основную часть циркулирующих в кровотоке метаболитов витамина D, тогда как альбумин является вторым по значимости транспортным белком, особенно у пациентов с низкой концентрацией DBP в сыворотке. Поскольку было открыто, что сайты связывания стероидов заняты лишь у 1–2% от общего количества циркулирующего DBP, инициировано активное изучение других потенциальных биологических ролей этого белка: утилизация актина, регуляция процессов воспаления и механизмов врожденного иммунитета, связывание жирных кислот, влияние на метаболизм костной ткани и связь с патогенезом опухолевых заболеваний. Данный обзор посвящен рассмотрению основных известных биологических функций DBP.

Ключевые слова

витамин D-связывающий белок, витамин D, транспортные белки, воспаление, хемотаксис

Полный текст

Введение

Витамин D-связывающий белок был обнаружен в 1960-е гг. в качестве полиморфного белка сыворотки крови с генетически предопределенными небольшими различиями в электрофоретической активности. Ему было дано название «группоспецифический компонент» (group-specific component, GC). Примерно в это же время был обнаружен транспортный белок метаболитов витамина D в сыворотке (vitamin D-binding protein, DBP). В середине 1970-х гг. несколькими лабораториями независимо было установлено, что GC и DBP — один и тот же белок [1–3].

DBP является слабогликозилированным (0,5–1%) α2-глобулином с молекулярной массой 52–59 кДа. Ген, кодирующий DBP, относится к мультигенному кластеру, который также включает гены, кодирующие альбумин, α-фетопротеин и α-альбумин/афамин, и расположен на длинном плече хромосомы 4 в локусе 4q11–q13. Все четыре гена экспрессируются преимущественно в печени и имеют гомологичную трехдоменную структуру, предположительно возникшую в результате трипликации 192-аминокислотной последовательности в гене-предшественнике [4]. Для DBP характерно большое количество полиморфизмов, что подтверждается историей его открытия и изучения. До признания роли этого белка в качестве переносчика метаболитов витамина D полиморфизмы DBP использовались популяционными генетиками для отслеживания различных популяций, при этом исследователи ссылались на белок под названием «Gc-глобулин». Более 120 вариантов описано на основе электрофоретических свойств, к настоящему моменту в базе данных NCBI числится уже более 1200 полиморфизмов. Из этих вариантов наиболее распространены DBP1F и DBP1S (локус rs7041) и DBP2 (локус rs4588). DBP1F и DBP1S включают два полиморфизма, один по аминокислоте 432 (416 в зрелом DBP) и один в положении 436 (420 в зрелом DBP). Аллель 1F кодирует последовательность между 432 и 436 как DATPT, аллель 1S — как EATPT (рис. 1). Это небольшое различие обусловливает разницу в заряде молекулы, в силу чего DBP1F движется быстрее, чем DBP1S, во время электрофореза. Аллель DBP2 кодирует последовательность как DATPK, который при электрофорезе движется еще медленнее. Дополнительное различие вариантов DBP1 и DBP2 связано с особенностями гликозилирования молекулы. Треонин (Т) в DBP1 связывает N-ацетилгалактозамин (GalNAc), с которым, в свою очередь, в тандеме связываются галактоза и сиаловая кислота. Лизин (K) в аналогичном положении в DBP2 не гликозилирован. Это влияет на преобразование DBP в фактор активации макрофагов (DBP-MAF), заключающееся в частичном дегликозилировании с удалением галактозы и сиаловой кислоты за счет последовательного действия сиалидазы и β-галактозидазы Т- и В-клеток [5]. Биологическое значение данной трансформации описано ниже. Таким образом, циркулирующий в кровотоке DBP является смесью немодифицированных и О-гликозилированных молекул: две из трех самых распространенных изоформ DBP (DBP1S и DBP1F) могут быть гликозилированы по треонину в 420-й позиции трисахаридом, состоящим из GalNAc с двумя разветвленными остатками сахаров галактозы и сиаловой кислоты.

Географические различия во встречаемости аллелей DBP ассоциированы с пигментацией кожи и воздействием солнечного излучения: в популяциях со светлой кожей относительно реже встречается аллель DBP1F и чаще (до 60%) — аллель DBP1S, в популяциях с африканским происхождением широко распространена аллель DBP1F, а среди лиц европеоидной расы — DBP2 [6].

Регуляция синтеза

Синтез DBP является эстроген-зависимым процессом и происходит в гепатоцитах. Максимальная концентрация DBP определяется в кровотоке, однако он может быть обнаружен и в других биологических жидкостях (моче, грудном молоке, асцитической, спинномозговой, семенной жидкостях, слюне) [7]. Как и в случае со многими вырабатываемыми печенью белками, транскрипция гена DBP регулируется ядерными факторами гепатоцитов (hepatic nuclear factors) HNF1α и 1β, однако, в отличие от альбумина, HNF1α повышает экспрессию гена DBP, а HNF1β снижает [8].

Эстрогены повышают экспрессию гена DBP, что отмечено при таких состояниях, как беременность и прием оральных контрацептивов, для которых характерно повышение уровня DBP [9, 10]. Сниженные концентрации DBP сыворотки крови выявлены у пациентов с циррозом печени, синдромом мальабсорбции, различными болезнями почек, при состояниях, приводящих к потере DBP с мочой, а также при генетической или приобретенной утрате мегалина или кубулина — белков, функционирующих как карго-рецепторы для реабсорбции белков после их фильтрации в клубочках нефронов [11].

Дексаметазон и некоторые интерлейкины (например, ИЛ-6) повышают продукцию DBP, что предположительно обусловливает наблюдаемое при травмах и нарушении функции печени повышение уровня DBP, тогда как фактор роста опухоли β (TGFβ) снижает его продукцию [12]. Первичный гиперпаратиреоз ассоциирован со сниженными уровнями DBP, что может обусловливать низкие уровни 25(ОН)D у этих пациентов [13]; на основании отрицательной корреляции между уровнями паратгормона и как DBP, так и альбумина сделано предположение, что высокий уровень интактного паратгормона может снижать синтез DBP. У пациентов с сахарным диабетом 1 типа наличие альбуминурии и потеря DBP с мочой могут приводить к снижению концентрации DBP сыворотки крови [14, 15], которое, в свою очередь, может оказывать прямое или непрямое влияние на аутоиммунную деструкцию β-клеток поджелудочной железы. Небольшое повышение DBP при акромегалии отмечено в одном исследовании [16]. Метаболиты витамина D не регулируют продукцию DBP самостоятельно [17].

Рис. 1. Различия в структуре самых распространенных изоформ DBP и образование DBP-MAF. Аллель 1F кодирует последовательность между аминокислотами 432 и 436 как DATPT, аллель 1S — как EATPT, аллель 2 — как DATPK. Две из трех указанных изоформ (DBP1F и DBP1S) могут быть гликозилированы по треонину в 420-й позиции трисахаридом. Частичное дегликозилирование с удалением галактозы и сиаловой кислоты за счет последовательного действия сиалидазы и β-галактозидазы Т- и В-клеток приводит к образованию из DBP фактора активации макрофагов (DBP-MAF).

DBP является острофазным белком сыворотки крови и повышается при инфекционных процессах или небольших травмах. При значительной травме (например, переломе бедра) или тяжелом состоянии (например, у пациентов в реанимации) может наблюдаться снижение DBP более чем на 10%; точный патогенез этого явления не вполне ясен [18]. Небольшое влияние на концентрацию DBP в сыворотке крови оказывает генотип DBP: у гомозигот с генотипом DBP2 уровни DBP ниже примерно на 10% по сравнению с носителями DBP1 [19].

Измерение концентрации DBP

В норме концентрация DBP в сыворотке крови человека соответствует микромолярному диапазону. Указываемые лабораториями средние концентрации DBP находятся в диапазоне от 200 до 600 мг/л; эти различия по большей части обусловлены использованием различных методов определения DBP, а также отсутствием их стандартизации. Концентрации DBP достаточно высоки для применения иммунохимических методов. Более ранние используемые методы включают радиоиммунный анализ и однонаправленную простую электроиммунодиффузию. В последние годы применяются также турбидиметрия, нефелометрия, иммуноферментный анализ (ИФА) и высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) [20–23]. Преимуществом последней является возможность одномоментного определения различий в изоформах DBP.

Функции DBP

Транспорт метаболитов витамина D

DBP является основным транспортным белком для всех метаболитов витамина D: в норме около 85% циркулирующих в кровотоке метаболитов связаны с DBP, тогда как альбумин связывает практически 15% оставшихся метаболитов, и менее 1% метаболитов находится в кровотоке в несвязанном виде [6]. Нужно отметить, что для DBP характерен примерно в 300 раз меньший суточный объем продукции в сравнении с альбумином. Период полужизни DBP в сыворотке составляет около 1,7 сут, что значимо меньше периода полужизни 25(OH) D — основного циркулирующего метаболита витамина D; период полужизни альбумина в сыворотке сопоставим с периодом полужизни 25(OH)D. В отличие от альбумина, который имеет несколько низкоаффинных сайтов связывания, у DBP только один сайт связывания для всех метаболитов, расположенный в домене А.

Большинство исследований, посвященных изучению аффинности различных метаболитов витамина D к DBP, указывают на то, что для 25(OH)D-лактонов характерна самая высокая аффинность, также достаточно высокая — для 25(OH)D (~1,5 × 10⁸ M⁻¹ при температуре 37 °С), 24R,25(OH)₂D и 25S,26(OH)₂D; аффинность DBP к 1,25(OH)₂D примерно в 10–100 раз меньше, чем к 25(ОН)D; наконец, минимальная аффинность наблюдается к нативному витамину D. Между метаболитами D₃ и D₂ отмечены небольшие различия в аффинности — до 20% различий между 25(ОН)D₃ и 25(ОН)D₂. Имеющиеся на настоящий момент данные позволяют предположить, что генотип DBP не оказывает значимого влияния на аффинность к 25(ОН)D [18].

Концентрация DBP в кровотоке в разы больше, чем сумма всех метаболитов витамина D: референсный диапазон DBP лежит в микромолярном интервале, тогда как концентрация основного метаболита витамина D (25(OH)D) в сыворотке крови, как правило, ниже 100 нмоль/л. В связи с этим лишь небольшая фракция DBP (менее 5%) представлена комплексом DBP и метаболита витамина D, и практически весь DBP циркулирует как апопротеин; эта ситуация отлична от большинства остальных транспортных белков лигандов ядерных рецепторов. Такой значительный молярный избыток DBP может иметь несколько биологических функций: защита от токсического действия избытка витамина D и резервуар для формы, являющейся «депо» витамина D, — 25(ОН) D [24].

DBP необходим для утилизации витамина D, образующегося в коже в результате воздействия УФ-излучения. На животных моделях было показано, что в отсутствие DBP УФ-излучение не способно скорректировать низкие уровни витамина D, несмотря на нормальную продукцию витамина D в коже [25].

Свободные 25(OH)D и 1,25(OH)₂D могут быть рассчитаны на основании концентрации DBP и аффинности метаболитов к DBP; концентрация свободного 25(ОН)D также может быть измерена напрямую, для чего первоначально использовался метод ультрафильтрации [26], однако на смену ему пришел более простой метод ИФА [27].

В силу ряда обстоятельств в настоящее время не вполне ясно, являются ли свободные 25(OH)D и 1,25(OH)₂D более точной характеристикой состояния здоровья в соответствии с гипотезой «свободного гормона», утверждающей, что связанные с белком гормоны биологически неактивны, тогда как биологические функции реализует свободная фракция. Вероятно, особое значение определение прямых метаболитов приобретает при состояниях, связанных с отклонениями от нормы концентрации DBP или его аффинности к лигандам. Прогностическая ценность расчетных значений свободных метаболитов витамина D неизвестна в силу отсутствия стандартизации определения концентрации DBP и точного значения константы аффинности к DBP при 37 °С. В норме отмечена сильная положительная корреляция между измеренным напрямую и расчетным свободным 25(ОН)D, а также обеих величин с общим 25(ОН)D [28, 29]. Кроме того, поскольку отсутствует корреляция между уровнем общего 25(ОН)D и DBP [30], предполагается, что уровень свободного 25(ОН)D не регулируется по принципу обратной связи.

В ряде исследований in vitro показано, что присутствие DBP снижает доступность и функцию метаболитов витамина D [31], что выступает в пользу применимости теории «свободного гормона» к витамину D. В отличие от 25(ОН) D, уровень общего 1,25(ОН)₂D положительно коррелирует с уровнем DBP [30, 32], что способствует поддержанию неизменной концентрации свободного активного метаболита витамина D в сыворотке. Однако расчетная концентрация свободного 1,25(OH)₂D (±10^–13 М) на несколько порядков ниже, чем концентрация связанного с рецептором витамина D метаболита (константа диссоциации равна 10^–10 М) [33], что также является аргументом при критике теории «свободного гормона».

Связывание с рецептором мегалина-кубулина

Поддержание стабильной концентрации 25(ОН)D в сыворотке крови и превращение 25(ОН)D в 1,25(ОН)₂D регулируется мегалин-опосредованным эндоцитозом комплексов 25(ОН)D и DBP в клетках проксимальных почечных канальцев нефронов [11]. Мегалин является мембранным рецептором и экспрессируется преимущественно в клетках почечных канальцев, располагаясь на апикальной (просветной) мембране. Используя кубулин в качестве корецептора, он связывает большое количество низкомолекулярных белков в просвете почечного канальца, тем самым предотвращая потерю важных для организма веществ с мочой [34]. Поскольку CYP27B1 (фермент, превращающий 25(ОН)D в 1,25(ОН)₂D) имеет доступ к 25(ОН)D не только с апикальной стороны клеток почечных канальцев, но и с базальной (где преимущественное значение играет свободный 25(ОН) D), предполагается, что мегалин-опосредованный путь не является незаменимым для синтеза активной формы витамина D в почках. На мышиных моделях было показано, что при полном отсутствии как мегалина [35], так и DBP [36] не развивается рахит при условии полной компенсации пищевыми источниками потерь метаболитов витамина D с мочой. Интернализация DBP вне почек, вероятно, может происходить и мегалин-независимым путем, как показано в В- и Т-лимфоцитах [37]. В 2019 г. был описан первый случай истинного полного дефицита DBP у 58-летней канадской женщины с очень низкими сывороточными концентрациями 25(OH)D и 1,25(OH)₂D и неопределяемым уровнем DBP (все измерения проводились методом ВЭЖХ-МС/МС) [38]. Несмотря на выявленные лабораторные отклонения, у пациентки не было рахита в анамнезе или признаков остеомаляции, сывороточные концентрации кальция и ПТГ были нормальными. При обследовании была обнаружена гомозиготная делеция всей области гена GC и части соседнего гена NPFFR2.

Связывание и утилизация внеклеточного актина

При обширном поражении тканей и клеточной гибели в кровоток попадает значимое количество актина — высококонсервативного белка, в большом количестве представленного в клетках эукариотов. Полимеризованная форма актина (F-актин) в ассоциации с фактором коагуляции Va участвует в запуске синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС), приводящего к полиорганной недостаточности. Система утилизации внутриклеточного актина, состоящая из гельзолина и DBP, противостоит указанным процессам коагуляции: гельзолин разрезает и деполимеризует филаменты актина, а DBP, обладая высокой аффинностью к глобулярному актину (G-актину), предотвращает его реполимеризацию. Комплексы G-актина и DBP быстро захватываются и утилизируются клетками печени, легких и селезенки [39]: период полувыведения, связанного с актином DBP, составляет около 30 мин, тогда как свободного DBP — 12–24 ч [40].

Важная роль системы утилизации актина продемонстрирована при тяжелом сепсисе [41], болезнях печени [42], дыхательной недостаточности [43], преэклампсии [44, 45], обширных ожогах [46]. При острых состояниях отмечается падение концентрации DBP в сыворотке крови [47, 48] с повышением концентрации комплексов актина и DBP [49–51]. Способность к повышению уровня DBP в ответ на травму коррелирует с выживанием [52].

Связывание жирных кислот

DBP связывает жирные кислоты, при этом, в отличие от альбумина, имеет единственный сайт связывания и более низкую аффинность (константа аффинности равна 10⁵–10⁶ М^–1) [53]. Большинство связанных с DBP жирных кислот являются мононенасыщенными и лишь 5% — полиненасыщенными; при этом только полиненасыщенные жирные кислоты, такие как арахидоновая и линолевая, конкурируют с метаболитами витамина D за связывание с DBP [54, 55]. Этот факт позволяет предположить, что жирные кислоты не конкурируют напрямую с метаболитами витамина D за связывание с DBP, а способны различным образом изменять конфигурацию DBP, что, в свою очередь, оказывает влияние на его связывание с метаболитами витамина D. Роль DBP в транспорте жирных кислот представляется ограниченной.

DBP и фактор активации макрофагов

Еще одна важная функция DBP — способность активировать макрофаги, которую DBP приобретает в результате сайт-специфического селективного дегликозилирования ферментами β-галактозидаза и сиалидаза, локализованными на клеточных мембранах, активированных В- и Т-лимфоцитов соответственно. В результате образуется активный белок DBP-MAF, содержащий остаточный сахар N-ацетилгалактозамин с освободившимися от галактозы и сиаловой кислоты сайтами связывания [56]. В одной из более поздних работ, однако, поставлена под сомнение способность β-галактозидазы дегликозилировать DBP [57]. Как было сказано ранее, образование DBP-MAF возможно только из изоформ DBP1S и DBP1F, которые имеют гликозилированную фракцию. Полное дегликозилирование DBP под действием фермента N-ацетилгалактозаминидазы (нагалазы) приводит к разрыву связи N-ацетилгалактозамина с треонином, и таким образом нагалаза блокирует конверсию DBP в DBP-MAF [58].

DBP-MAF и его 14-аминокислотная синтетическая производная, содержащая сайт гликозилирования, обладают анаболическим эффектом в отношении костной ткани, что может быть использовано при лечении остео-пороза и других костных болезней [59]. Также на животных моделях продемонстрирована способность DBP-MAF независимо от связывания 25(ОН)D активировать остеокласты, в результате чего терапия DBP-MAF может частично корректировать скелетные нарушения при остеопетрозе [53].

В ряде экспериментальных работ in vitro и in vivo, а также в клинических испытаниях показана неординарная эффективность DBP-MAF при лечении опухолевых заболеваний и ВИЧ-инфекции [60, 61]. Предполагается, что противоопухолевый эффект DBP-MAF обусловлен несколькими механизмами, такими как активация макрофагов, прямое ингибирование пролиферации, миграции и метастазирования опухолевых клеток, а также подавление неоангиогенеза в опухолевой ткани [62]. У пациентов с раком наблюдается повышенная продукция нагалазы печенью [63], а обратная корреляция между активностью нагалазы и концентрацией DBP позволяет предположить, что полное дегликозилирование DBP нагалазой и блокирование образования DBP-MAF являются значимыми механизмами иммуносупрессии у этих пациентов [63, 64].

Многие из указанных исследований выполнены в лаборатории Yamamoto, ряд статей которого был отозван после публикации с формулировкой «некорректно проведенные клинические испытания и некорректно оформленная документация, сопровождающая эти испытания». Несмотря на это, противоопухолевые свойства DBP-MAF продолжают активно изучаться во многих странах. В Японии DBP-MAF как лекарственная форма разрешен для практического применения: на базе клиники Saisei Mirai (Токио) пролечено более 3 тыс. больных различными формами рака с использованием интегративной иммунотерапии, одним из компонентов которой является DBP-MAF [62]. В Израиле завершена первая фаза клинических испытаний DBP-MAF [65].

Участие в хемотаксисе

Появляется все больше свидетельств того, что DBP играет важную роль в работе иммунной системы, участвуя в комплемент-опосредованном привлечении нейтрофилов при воспалении. Комплекс, состоящий из DBP, CD44 (гликопротеин, расположенный на клеточной мембране нейтрофилов и обладающий функцией мембранного рецептора) и аннексина А2, способен усиливать эффекты компонентов комплемента — хемоаттрактантов: С5а и его стабильной формы, не имеющей С-концевого аргинина (С5а дез-Арг) [66]. Еще один гликопротеин, происходящий из тромбоцитов, — тромбоспондин-1 способствует усилению DBP С5а-опосредованного хемотаксиса нейтрофилов, связываясь со своими рецепторами CD36 и CD47 [67]. Данная функция DBP в отношении лейкоцитов является специфической, так как он не способен усиливать другие С5а-опосредованные функции лейкоцитов, такие как образование активных форм кислорода и дегрануляцию [68]. При этом DBP может усиливать активность других хемоаттрактантов, например CXCL1 [69]. Метаболиты витамина D (по некоторым данным, 1,25(OH)₂D, но не 25(OH)D [70]) конкурентно связываются с DBP и тем самым оказывают ингибирующее влияние на хемотаксис [71].

Заключение

Имеющиеся результаты исследований свидетельствуют о том, что помимо своей основной функции – транспорта метаболитов витамина D – DBP обладает рядом других важных свойств: способствует утилизации актина внутри сосудов, связывает жирные кислоты, активирует макрофаги, участвует в хемотаксисе. Измеренная концентрация DBP может не только дать ценную информацию при оценке статуса витамина D, но и стать новым биохимическим маркером при различных патологических состояниях, в связи с чем требуется стандартизация методов определения DBP. Вызывают интерес исследования, указывающие на связь между полиморфизмами гена DBP и подверженностью различным заболеваниям.

Способность организма реагировать на повреждение путем увеличения выработки DBP коррелирует с выживанием и заставляет задуматься об использовании DBP в терапевтических целях. Исследования DBP-MAF являются многообещающими, однако необходимо проведение рандомизированных контролируемых исследований, чтобы оценить перспективы данной молекулы в клинической практике.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Поисково-аналитическая работа осуществлена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-15-00243).

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. Романова А.А. — сбор и анализ источников литературы, формирование дизайна статьи, основных разделов публикации; А.А. Поваляева — написание статьи, визуализация, формулирование заключения, оформление текста в соответствии с требованиями журнала; А.Ю. Жуков — редакция текста в соответствии с нормами русского языка, орфографическая, синтаксическая и пунктуационная корректура; Е.А. Пигарова, Л.К. Дзеранова — проверка и редактирование текста, придание смыслового единства; Л.Я. Рожинская — стилистический контроль научной публикации. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили итоговую версию до публикации.