Иммуногенные и протективые свойства кандидатной пептидной вакцины против SARS-CoV-2

Полный текст

Обоснование

Коронавирусы семейства Coronaviridae, циркулирующие в человеческой популяции и являющиеся причиной острых респираторных инфекций, периодически вызывают вспышки тяжелых инфекций, в частности тяжелого острого респираторного синдрома (возбудитель — SARS-CoV) или ближневосточного респираторного синдрома (возбудитель — MERS-CoV). Новый коронавирус SARS-CoV-2, представитель рода Betacoronavirus, по сравнению с его близкими родственниками SARS-CoV и MERS-CoV способен очень быстро передаваться от человека к человеку, а летальность этого вируса превосходит смертность от вируса гриппа в 30–40 раз [1]. Пандемия, вызванная в 2019–2020 гг. вирусом SARS-CoV-2, поставила перед общественным здравоохранением всех стран мира актуальную задачу — создать эффективные терапевтические и профилактические препараты. В настоящее время разрабатывается более 180 различных вакцин против новой коронавирусной инфекции, которые представляют собой субъединичные, векторные реплицирующиеся, векторные нереплицирующиеся, инактивированные, живые аттенуированные вакцины, вакцины на основе нуклеиновых кислот и вирусоподобных частиц [2]. Разработка различного типа вакцин позволит применять эти препараты или их комбинации для создания защитного иммунитета у различных целевых групп населения.

Поверхностный вирусный белок S является основой большинства вакцин, разрабатываемых против нового коронавируса. Белок S вируса SARS-CoV-2 состоит из двух субъединиц. Субъединица S1 обеспечивает связывание вируса с рецептором АСЕ2, находящимся на мембране клеток-мишеней, а субъединица S2 — слияние оболочки вириона и мембраны клетки-мишени. Блокирование функций рецепторного связывания и слияния с мембраной клетки может обеспечить защиту от вирусной инфекции. Однако существует вероятность того, что использование полноразмерного S-белка SARS-CoV-2 может вызывать ряд побочных реакций, и наиболее серьезной из них может быть антителозависимое усиление инфекции, как это было ранее показано группой китайских ученых для S-белка SARS-CoV-1 [3].

Поэтому мы рассмотрели альтернативный подход к иммунизации против коронавируса, который обеспечивает формирование протективного иммунитета и исключает возможность развития антителозависимого усиления инфекции. Мы использовали технологию синтетических пептидных вакцин, которая включает этапы in silico конструирования нескольких иммуноактивных пептидных фрагментов вирусных белков, представляющих родственный вирусный антиген, этап химического синтеза пептидных антигенов и их конъюгирование на высокомолекулярный белок-носитель. Наиболее эффективные конструкции были отобраны для включения в композицию кандидатной пептидной вакцины после изучения их иммуногенности, антигенной специфичности и протективности на животных моделях (данные не приведены). Выбор пептидов был основан на опубликованных пространственных структурах гомологичного S-белка SARS-CoV-1 и данных о генетических последовательностях нового коронавируса SARS-CoV-2 [4, 5]. Эпитопы, расположенные рядом с жизненно важными для вируса участками, были сконструированы с использованием методов компьютерного моделирования. При проектировании исключены эпитопы, способные привести к антителозависимому усилению инфекции (включая пептид S597-603) или имеющие антигенное сходство с белками человека [3, 6–8]. С целью обеспечения устойчивости вакцины к возможным мутациям вируса, которые повлекут изменение антигенных свойств, выбирались эпитопы из наиболее консервативных участков белка S [7, 8]. Синтезированные пептиды были конъюгированы с белком-носителем, в качестве которого был выбран N-белок нового коронавируса, поскольку он консервативен и содержит вирус-специфические Т-клеточные эпитопы и, таким образом, также способствует формированию Т-клеток памяти. Нами была разработана синтетическая пептидная вакцина против нового коронавируса на основе химически синтезированных пептидов. Вакцина (ЭпиВакКорона) представляет собой суспензию для внутримышечного введения, содержащую композицию химически синтезированных пептидных иммуногенов S-белка коронавируса SARS-CoV-2, конъюгированных с белком-носителем и адсорбированных на гидроксиде алюминия.

Ожидаемыми преимуществами такой субъединичной вакцины относительно других вакцинных платформ являются:

• эффективность вакцины против антигенно изменяющихся штаммов, поскольку вакцина содержит консервативные эпитопы SARS-CoV-2;
• безопасность вакцины. В отличие от большинства субъединичных, пептидная вакцина содержит лишь короткие участки вирусного белка, что дополнительно увеличивает ее безопасность и позволяет использовать для лиц с ослабленным иммунитетом, при иммунодепрессивных и иммуносупрессивных состояниях;
• простота производства, стабильность компонентов дают возможность масштабировать выпуск сотен миллионов доз вакцины с использованием современных технологий твердофазного синтеза пептидов на автоматических синтезаторах;
• режим хранения и транспортировки от 2 до 8 °С позволяет использовать существующие логистические процессы.

Цель исследования — изучение специфических иммуногенных и протективных свойств кандидатной пептидной вакцины против SARS-CoV-2.

Методы

Животные

В работе были использованы лабораторные животные, чувствительные к коронавирусной инфекции, такие как низшие приматы, сирийские хомяки и хорьки. Низшие приматы двух видов (Chlorocebus aethiops, 8 самцов с исходной массой тела 4,8–6,3 кг в возрасте 5–16 лет, и Macaca mulatta, 8 самцов с массой тела 3,9–4,8 кг в возрасте 2,9–3 года) получены из питомника НИИ медицинской приматологии, г. Сочи, Россия. Сирийские хомяки, самцы и самки массой тела 0,09–0,12 кг, — из питомника ООО «КролИнфо», Россия; хорьки, самцы и самки массой тела 0,7–1,3 кг, — из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия.

Продолжительность исследования

Май–сентябрь 2020 г.

Изучение иммуногенных свойств вакцины ЭпиВакКорона

В исследовании использованы интактные, не содержащие антитела к вирусу SARS-CoV-2 хомяки, хорьки и низшие приматы. Хомяки очень чувствительны к SARS-CoV-2 и представляют собой хорошую модель для изучения данной инфекции. После интраназального заражения вирус реплицируется в верхних (ВДП) и нижних дыхательных путях и поражает легкие. Эта модель может использоваться для оценки протективных свойств вакцины, в патоморфологических и патогистологических исследованиях, в частности, может быть полезна для экспериментов по определению дозы и режима, обеспечивающих защиту от пневмонии. Две группы хомяков по 10 голов в каждой иммунизировали двукратно внутримышечно с интервалом в 14 сут двумя разными дозами вакцины ЭпиВакКорона, содержащими соответственно 86 и 260 мкг действующего вещества (0,3 и 1 вакцинирующая доза для человека соответственно). В работе использовались одноразовые трехкомпонентные шприцы объемом 1 мл с иглой 29G (ЦСКБ «Прогресс»). Третья группа получала плацебо — физиологический раствор 0,9% хлорида натрия.

Хорьки менее чувствительны к SARS-CoV-2, и для развития заболевания им требуются большие дозы вируса по сравнению с хомяками. У хорьков SARS-CoV-2 реплицируется в основном в ВДП, и обычно инфекция протекает без видимых клинических проявлений. Этот факт позволяет использовать хорьков для оценки протективных свойств вакцины при интраназальном способе заражения с оценкой вирусной нагрузки в смывах из носовой полости животных в разные моменты времени после заражения. В частности, такая модель может быть использована для исследования различий в протективных свойствах различных серий вакцины. Три группы хорьков по 6 голов в каждой иммунизировали двукратно внутримышечно тремя сериями вакцины ЭпиВакКорона в дозе 260 мкг действующего вещества (1 вакцинирующая доза для человека) с интервалом 14 сут. Использовались одноразовые трехкомпонентные шприцы объемом 1 мл с иглой 29G (ЦСКБ «Прогресс»). Четвертая группа животных получала плацебо — физиологический раствор 0,9% хлорида натрия.

Низшие приматы — самая близкая к человеку модель животных. Наиболее распространенными приматами, используемыми в исследованиях, являются африканские зеленые мартышки Chlorocebus aethiops и макаки-резусы Macaca mulatta. Однако известно, что эти два вида различаются как по своим иммунным реакциям, так и по устойчивости к инфекциям. Поэтому нас интересовало не только изучение иммуногенных и протективных свойств вакцины ЭпиВакКорона у приматов, но и сравнение иммунных ответов и восприимчивости к коронавирусной инфекции этих двух видов [9]. Низшие приматы, по 5 голов каждого вида, иммунизировались двукратно внутримышечно вакциной ЭпиВакКорона в дозе 260 мкг действующего вещества (1 вакцинирующая доза для человека) с интервалом 14 сут. Использовались одноразовые трехкомпонентные шприцы объемом 1 мл с иглой 29G (ЦСКБ «Прогресс»). По 3 примата каждого вида получали плацебо — физиологический раствор 0,9% хлорида натрия.

Через 14 и 28 дней после первой иммунизации у животных всех групп проводили забор крови и измеряли уровень антител в сыворотке против антигенов вируса SARS-CoV-2 в реакциях ИФА и вирусной нейтрализации.

Изучение протективных свойств вакцины ЭпиВакКорона

Все исследования по оценке протективных свойств вакцины проведены в максимально изолированной лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора при соблюдении требований безопасной работы с микроорганизмами I–II групп патогенности. В работе использовали вирус SARS-CoV-2, штамм nCoV/Victoria/1/2020, наработанный на культуре клеток Vero E6 до титра вируса 10⁷ фокусобразующих единиц на миллилитр (ФОЕ/мл). Хомяков и хорьков заражали интраназально дозой 10² и 10³ ФОЕ соответственно через 28–30 дней после первого введения вакцины ЭпиВакКорона. За животными наблюдали в течение 14 дней после заражения, регистрируя появление клинических признаков заболевания и определяя вирусную нагрузку в смывах из носа. Приматов заражали интраназально дозой 10⁶ ТЦД50 вируса SARS-CoV-2, штамм nCov/Victoria/1/2020, через 30 дней после первого введения вакцины. За животными наблюдали в течение 14 дней после заражения, регистрируя появление клинических признаков заболевания и определяя вирусную нагрузку в мазках из носа.

Определение вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в биологических образцах на культуре клеток

Смывы из носовой полости лабораторных животных использовали для приготовления 10-кратных разведений с последующим их посевом на монослой культуры клеток Vero Е6 в 96-луночных планшетах. Из лунок плоскодонного планшета с монослоем клеток удаляли ростовую среду, монослой промывали 2 раза поддерживающей питательной средой (ДМЕМ, 100 ед./мл бензилпенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 300 мкг/мл L-глютамин, 2% сыворотки крови плодов коровы). Вносили разведения исследуемых образцов, инкубировали 1 ч при температуре 37 °С в условиях 5% CO₂, после чего среду из лунок удаляли и планшет 1 раз промывали поддерживающей средой. Во все лунки планшета вносили по 150 мкл поддерживающей среды. После 18–20 ч инкубации при температуре 37 °С в условиях 5% CO₂ среду из лунок удаляли, добавляли по 100 мкл 80% ацетона (охлажденного до –20 °С), инкубировали в течение 10–15 мин, удаляли ацетон и планшет промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР). Далее в каждую лунку добавляли по 100 мкл разведения моноклональных антител человека к вирусу SARS-CoV-2 (Anti-N protein SARS-CoV-2 mAb_IgG “Sanyou Biopharmaceuticals”, соотношение антител к ФСБР 1:2000). Планшет инкубировали при температуре 37 °С в течение 1 ч, после чего лунки промывали ФСБР 4 раза и вносили вторичные антитела кролика к IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Abcam), в разведении 1:1000. Через 30 мин инкубации лунки промывали 4 раза ФСБР и вносили раствор субстрата AEC (3-amino-9-ethylcarbazole, Sigma). Через 30 мин инкубации раствор удаляли, планшет промывали 1 раз ФСБР, инфицированные клетки, окрашенные в красно-коричневый цвет, подсчитывали в инвертированном микроскопе, определяли титр вирусу в количестве фокусобразующих единиц на 1 мл смыва (ФОЕ/мл).

Определение вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в биологических образцах методом RT-PCR

Выделение РНК из смывов из носовой полости проводили с использованием набора реагентов «Рибо-сорб» (ЦНИИЭ, Россия) согласно инструкции производителя. Синтез кДНК из выделенной РНК проводили с использованием набора реагентов для реакции обратной транскрипции «Реверта-L» (ЦНИИЭ, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию фрагментов кДНК вируса SARS-CoV-2, предварительно синтезированных на матрице РНК вируса SARS-CoV-2 в реакции обратной транскрипции, проводили с использованием набора реагентов «Вектор-ПЦРРВ-COVID-19-RG» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) согласно инструкции производителя. Результаты исследования интерпретировали в соответствии с инструкцией к набору.

Определение вирусспецифических антител при помощи ИФА

Специфические антитела были идентифицированы с использованием инактивированного вируса SARS-CoV-2, штамм nCoV/Victoria/1/2020, наработанного на культуре клеток Vero E6. Иммуносорбент представляет собой 96-луночный полистирольный планшет с высокой сорбционной способностью, содержащий иммобилизованный инактивированный природный антиген SARS-CoV-2. Инактивацию природного антигена вируса проводили с использованием бета-пропиолактона путем его внесения в очищенный осаждением антиген в конечной концентрации 0,5%. Инкубацию проводили в течение 2 ч при температуре 4 °С при перемешивании, после чего прогревали в течение 2 ч при температуре 37 °С. Для титрования готовили двукратные разведения сывороток крови животных, иммунизированных вакциной, и животных контрольной группы (неиммунизированных) в интервале 1:40–1:2560. После инкубации в течение 30 мин при температуре 37 °С производили 5-кратную отмывку лунок планшета PBST c Tween-20. После завершения процедуры отмывки в лунки вносили по 100 мкл раствора конъюгата протеина А золотистого стафилококка с пероксидазой хрена в конечной концентрации 1,26 мкг/ мл («Биосан», Новосибирск). После 30-минутной инкубации при температуре 37 °С лунки промывали и вносили 0,05% раствор тетраметиленбензидина. Оптическую плотность растворов измеряли при длине волны 450 нм. Титром антител считается максимальное разведение исследуемой сыворотки, при котором оптическая плотность раствора превышает среднее значение оптической плотности отрицательного контроля.

Определение вируснейтрализующих антител на культуре клеток Vero

Исследуемые сыворотки перед постановкой реакции нейтрализации вируса подвергали термоинактивации при 56 °С в течение 30 мин. В стерильном круглодонном планшете готовили серийные двукратные разведения исследуемых сывороток на поддерживающей питательной среде (ДМЕМ, 100 ед./мл бензилпенициллина, 100 мкг/ мл стрептомицина, 300 мкг/мл L-глютамин, 2% сыворотки крови плодов коровы (Invitrogen)). В каждую лунку планшета, кроме контроля клеток, вносили вирусную суспензию, содержащую 200 ФОЕ вируса SARS-CoV-2, и инкубировали 1 ч при температуре 37 °С. Далее использовали плоскодонный 96-луночный планшет с монослоем клеток Vero Е6 более 90% конфлуентности. Из лунок плоскодонного планшета с монослоем клеток Vero удаляли ростовую среду, монослой промывали 2 раза поддерживающей средой. После окончания 60-минутной инкубации из круглодонного планшета с разведениями сывороток переносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета с монослоем клеток. Инкубировали 1 ч при температуре 37 °С в условиях 5% CO₂, после чего среду из лунок удаляли и планшет 1 раз промывали поддерживающей средой. Во все лунки планшета вносили по 150 мкл поддерживающей среды. Далее проводили процедуру окрашивания ФОЕ. После 18–20 ч инкубации при температуре 37 °С в условиях 5% CO₂ среду из лунок удаляли, добавляли по 100 мкл 80% ацетона (охлажденного до –20 °С), инкубировали в течение 10–15 мин, удаляли ацетон и планшет промывали ФСБР. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл разведения моноклональных антител человека к вирусу SARS-CoV-2 (Anti-N protein SARS-CoV-2 mAb_IgG “Sanyou Biopharmaceuticals”, соотношение антител к ФСБР 1:2000). Белок N экспрессируется в гораздо больших количествах, чем S-белок, что позволяет визуализировать зараженные клетки с высокой чувствительностью антител к белку N. Планшет инкубировали при температуре 37 °С в течение 1 ч, после чего лунки промывали ФСБР 4 раза и вносили вторичные кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Abcam), в разведении 1:1000. Через 30 мин инкубации лунки промывали 4 раза ФСБР и вносили раствор субстрата AEC (3-amino-9-ethylcarbazole, Sigma). Через 30 мин инкубации раствор удаляли, планшет промывали 1 раз ФСБР, инфицированные клетки, окрашенные в красно-коричневый цвет, подсчитывали в инвертированном микроскопе, определяли титр вируса в количестве фокусобразующих единиц на 1 мл смыва (ФОЕ/мл).

Титром нейтрализующих антител сыворотки считается разведение, при котором количество ФОЕ уменьшается на 50% по сравнению со средним значением ФОЕ в контрольных лунках.

Гистологические исследования

Гистологическое исследование проводили для образцов из легких хомяков и приматов через 6–7 сут после интраназального заражения коронавирусом SARS-CoV-2, штамм nCoV/Victoria/1/2020. Образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина для гистологических исследований («БиоВитрум», Россия) в течение 48 ч. Обработку материала проводили по общепринятой методике: последовательное обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, пропитывание в смеси ксилол–парафин и заливка в парафиновые блоки. Парафиновые срезы толщиной 4–5 мкм готовили с помощью автоматического ротационного микротома НМ-360 (Германия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Светооптическое исследование и микрофотосъемку проводили на микроскопе AxioImager Z1 (Zeiss, Германия) с использованием программного пакета AxioVision 4.8.2 (Zeiss, Германия).

Рентгенологические исследования

Рентгеновские снимки органов грудной полости животных получали на рентгеновском аппарате GIERTH HFX90V (Германия/Япония) с цифровой рентгенографической системой SCOPE 801CW Ultraleicht с беспроводным плоскопанельным детектором (27,4 × 35 см) CDXI-801CW и управляющим программным обеспечением CANON NE. Рентгенограммы были получены при мощности облучения 52 кВ и экспозиции 0,06 мАс/с. Рентгенографию выполняли на приматах, которым вводили внутримышечно золетил 100 (Virbac) и Xyla (Голландия) в дозах 10 мг/кг и 10 мг/животное соответственно.

Этическая экспертиза

Все процедуры с животными, запланированные в доклиническом исследовании, были рассмотрены и утверждены биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (заявка ГНЦ ВБ «Вектор»/02-05.2020).

Статистический анализ

Анализ динамики изученных показателей внутри исследуемых групп проводился с использованием метода Фридмана и апостериорного теста Неменьи. Статистический анализ парных выборок осуществлялся с помощью теста Уилкоксона, анализ непарных выборок — с помощью теста Краскела–Уоллиса и апостериорного теста Данна. Попарные сравнения несвязанных выборок также проводились с помощью теста Манна–Уитни. Поправка на множественное тестирование во всех случаях проводилась методом Бонферрони. Частотный анализ осуществлялся с помощью точного теста Фишера (при сравнении двух групп) или с помощью теста Фишера–Фримана–Гальтона (при сравнении трех групп и более). Статистический анализ и построение графиков выполнялись с помощью специализированной программной среды для вычислений и статистического анализа R [10–12].

Результаты

Дизайн вакцины

Пептидная вакцина, содержащая короткие иммуногенные пептиды, конъюгированные с белком-носителем, вызывает сильные и целенаправленные иммунные ответы только на несколько В-клеточных эпитопов, которые расположены в функционально важных сайтах вирусных белков. Для создания вакцины были использованы данные рентгеноструктурного анализа белков коронавируса и информация о генетических последовательностях, кодирующих белки нового коронавируса, полученная из базы данных GISAID [4, 5]. Линейные эпитопы B-клеток в S-белке, расположенные рядом с жизненно важными для вируса сайтами, были разработаны с использованием методов компьютерного моделирования. При разработке мы исключили эпитопы, которые могут привести к антителозависимому усилению инфекции или имеют антигенное сходство с белками человека и могут вызывать иммунопатологическую реакцию [6–8]. Чтобы обеспечить устойчивость вакцины к возможным мутациям вируса, которые могли бы привести к изменению антигенных свойств, эпитопы были выбраны из наиболее консервативных областей S-белка [7, 8]. В общей сложности семь пептидов длиной 20–31 аминокислотный остаток, несущих линейные B-клеточные эпитопы S-белка, были сконструированы и химически синтезированы, а затем конъюгированы с химерным рекомбинантным белком-носителем [14]. Такие пептиды-иммуногены несут минимально необходимые антигенные детерминанты для формирования специфического иммунного ответа и содержат антигенные участки белка S нового коронавируса SARS-CoV-2, являющиеся иммуногенными для модельных животных и человека и индуцирующие протективный иммунитет против заражения коронавирусом SARS-CoV-2. Для усиления иммуногенности пептидов последние конъюгировали с белком-носителем, содержащим нуклеопротеин NP вируса SARS-CoV-2. Белок NP консервативен, не индуцирует вируснейтрализующие антитела, но содержит вирусспецифические Т-клеточные эпитопы и участвует в формировании Т-клеток памяти. NP-специфические Т-клетки детектировались у большего числа пациентов, чем для других вирусных белков, а количество NP-специфических Т-клеток, секретирующих IFN-γ, было намного выше, чем для S-RBD [13]. Эти семь активных веществ вакцин-кандидатов адсорбировали на гидро-ксиде алюминия. Такая синтетическая пептидная вакцина вместо многих десятков и сотен эпитопов, присутствие которых типично для обычных вакцин, содержит только несколько эпитопов, нацеленных на индукцию сфокусированного защитного иммунного ответа.

Семь групп хорьков были дважды внутримышечно иммунизированы семью вакцинными кандидатами для оценки иммуногенности и защитной способности каждой конструкции против нового коронавируса (каждой группе животных вводился свой прототип вакцины). Были отобраны три наиболее иммуногенных и протективных пептидных иммуногена: RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS, KEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE и KNLNESLIDLQELGKYEQYIK. Пептид RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS соответствует участку рецептор-связывающего мотива S-белка вируса SARS-CoV-2, а два других соответствуют участку вблизи трансмембранного домена «ножки» S-белка, блокирование этого участка затрудняет слияние вирусной оболочки и клеточной мембраны. Три пептидных конъюгата, смешанные в соотношении 1:1:1 и адсорбированные на гидроксиде алюминия, представляют собой действующее начало пептидной вакцины ЭпиВакКорона (рис. 1).

 

Рис. 1. Схематическое изображение расположения эпитопов S-белка.

Источники: Использованы материалы [10], ProteinDataBase 6ACJ.pdb и CDCImageLibraryPHILID #23312.

 

Иммуногенность вакцины ЭпиВакКорона

На первом этапе работы изучались иммуногенные свойства вакцины ЭпиВакКорона на лабораторных животных (хомяках, хорьках, низших приматах). Всем животным препарат вводился двукратно с интервалом 14 сут между инъекциями, способ введения — внутримышечный.

На рис. 2 приведены результаты исследования иммуногенности вакцины ЭпиВакКорона на хомяках и хорьках.

На 14-е сут после второй иммунизации хомяков двумя разными дозами — 260 и 86 мкг — вакцина индуцирует иммунный ответ у 100% хомяков на антигены вакцины. Трехкратное уменьшение дозы вакцины приводит к дозозависимому уменьшению среднегеометрического титра (СГТ) на антигены вакцины. На 14-е сут после второй вакцинации СГТ в группе хомяков, получивших полную дозу вакцины, составляет 1:11943, в группе, получившей 1/3 дозы, — 1:6400 по отношению к антигену вакцины. При использовании цельновирионного антигена коронавируса SARS-CoV-2 СГТ составляет 1:4525 и 1:1600 для доз вакцины 260 и 86 мкг соответственно.

После иммунизации хорьков тремя сериями вакцины ЭпиВакКорона в дозе 260 мкг у 17 из 18 (94%) животных наблюдается появление специфических антител с титром от 1:800 до 1:6400 на 14-е сут после первой вакцинации. Через 14 сут после второй вакцинации у 100% хорьков формируется высокий уровень специфических антител и СГТ в трех группах хорьков, иммунизированных тремя сериями вакцины ЭпиВакКорона, и составляет 1:9051–1:10159 (см. рис. 2).

 

Рис. 2. Результаты исследования иммуногенности вакцины ЭпиВакКорона в эксприментах на хомяках и хорьках. Всем животным препарат вводился двукратно с интервалом 14 сут между инъекциями, способ введения — внутримышечный.

А, Б — титры антител в сыворотке крови перед введением вакцины ЭпиВакКорона, через 14 и 28 сут после первой иммунизации: A — хомяков, Б — хорьков; В, Г — титры вируснейтрализующих антител в сыворотке крови перед введением вакцины ЭпиВакКорона, через 14 и 28 сут после первой иммунизации: В — хомяков (проводили исследование двух доз вакцин — 260 и 86 мкг), Г — хорьков (проводили исследование трех серий вакцины в дозе 260 мкг)

 

Показано, что вакцина ЭпиВакКорона индуцирует антитела в высоких титрах у 100% приматов к антигенам вакцины и цельновирионному антигену коронавируса SARS-CoV-2 на 14-е сут после второй вакцинации (рис. 3).

 

Рис. 3. Гуморальный иммунный ответ на антигены коронавируса у вакцинированных ЭпиВакКорона зеленых мартышек и макак-резусов. Всем животным группы ЭпиВакКорона препарат вводился двукратно внутримышечно в дозе 260 мкг с интервалом 14 сут между инъекциями.

А, Б — титры антител в сыворотке крови приматов к антигену вакцины ЭпиВакКорона через 14, 21 и 28 дней после первой иммунизации: А — Chlorocebus aethiops, Б — Macaca mulatta; В, Г — титры антител в сыворотке крови приматов к антигенам инактивированного коронавируса SARS-CoV-2 через 14, 21 и 28 дней после первой иммунизации: В — Chlorocebus aethiops, Г — Macaca mulatta

 

У зеленых мартышек СГТ составляет 1:11143 к антигену вакцины и 1:10159 — к цельновирионному антигену коронавируса SARS-CoV-2, тогда как у макак-резусов в эти сроки СГТ к антигену вакцины составляет 1:12800, а к цельновирионному антигену коронавируса SARS-CoV-2 — 1:7352. У 100% зеленых мартышек обнаружены нейтрализующие антитела в титре 1:40 на 14-е сут после первой вакцинации.

Протективность вакцины ЭпиВакКорона

На 14-е сут после второй вакцинации всех иммунизированных животных интраназально заражали новым коронавирусом SARS-CoV-2 в дозе 10² ФОЕ для хомяков, 10³ ФОЕ — для хорьков и 10⁶ ТЦД50 — для приматов. Хомяков на 6-е и 14-е сут после заражения подвергали эвтаназии, измеряли индекс массы легкие/тело и проводили гистологическое исследование легких. На 6-е сут после заражения индекс массы легкие/тело в группе плацебо (0,0108 ± 0,0004 — средняя величина и стандартная ошибка) статистически значимо отличается от индекса в группах вакцинированных ЭпиВакКорона (для дозы 260 мкг — 0,0080 ± 0,0023, для дозы 86 мкг — 0,0086 ± 0,0008) (рис. 4).

 

Рис. 4. Протективность вакцины ЭпиВакКорона на хомяках и хорьках после заражения коронавирусом. Всем животным препарат вводился двукратно внутримышечно с интервалом 14 сут между инъекциями.

A, Б — вирусная нагрузка, измеренная по значению порогового цикла Ct, в носовом смыве на 2-, 4-, 6-, 8- и 10-й дни после интраназального заражения коронавирусом: А — хомяков (проводили исследование двух доз вакцины — 260 и 86 мкг), Б — хорьков (проводили исследование трех серий вакцины в дозе 260 мкг); В, Г — вирусная нагрузка, измеренная по количеству инфекционных центров ФОЕ, в носовом смыве на 2-, 4-, 6-, 8- и 10-й дни после интраназального заражения коронавирусом: В — хомяков (проводили исследование двух доз вакцины — 260 и 86 мкг), Г — хорьков (проводили исследование трех серий вакцины в дозе 260 мкг); Д, Е — индекс отношения массы легкие/ тело, измеренный на 6-е и 14-е сут после интраназального заражения коронавирусом: Д — хомяков (проводили исследование двух доз вакцины — 260 и 86 мкг), Е — хорьков (проводили исследование трех серий вакцины в дозе 260 мкг)

 

При гистологическом исследовании срезов легких тяжелые патологические изменения наблюдались в группе плацебо хомяков, где обнаруживались полная потеря эпителиальной выстилки мелких бронхов и бронхиол, очаги некротизации, плазматическое пропитывание стенок сосудов, значительные по площади зоны ателектаза. У животных, вакцинированных максимальной дозой 260 мкг вакцины ЭпиВакКорона, наблюдались только локальные явления отека и воспалительно-клеточной инфильтрации, на малых участках легочной паренхимы отмечались дистрофические изменения эпителия мелких бронхов и кровеносных сосудов микроциркуляторного русла (рис. 5).

 

Рис. 5. Гистологическое исследование легких хомяков, зараженных SARS-CoV-2. А, Б — легкие хомяков, иммунизированных вакциной ЭпиВакКорона, через 6 сут после заражения коронавирусом:

А — доза 260 мкг (наблюдаются ателектаз, плазморрагии, локальная выраженная воспалительно-клеточная инфильтрация лимфоидными клетками и нейтрофильными гранулоцитами, мелкие бронхи без эпителия, но диапедез либо слабый (лимфоциты), либо вообще малозаметный), Б — доза 86 мкг (выраженные ателектаз, распространенная инфильтрация нейтрофилами, васкулит и деструкции отдельных мелких бронхов, мелкие локусы некротизации, полости альвеол заполнены плазмой и эритроцитами); В — легкие невакцинированных хомяков через 6 сут после заражения коронавирусом (паренхима практически безвоздушна за счет альвеолярно-геморрагического синдрома и выраженной инфильтрации мононуклеарами, микроангиопатия, плазматическое пропитывание стенок сосудов, межальвеолярные перегородки резко утолщены, встречаются бронхиолиты и гиалиновые мембраны); Г — легкие невакцинированных хомяков до заражения коронавирусом.

 

Для хорьков показано, что на 6-е сут после заражения более чем в 100 раз снижается нагрузка по вирусной РНК в группах вакцинированных животных по сравнению с группой плацебо. Коронавирус из носовых смывов детектируется у 6 (33%) из 18 вакцинированных хорьков и у 100% животных в группе плацебо. На 8-е сут после заражения вирусная РНК выделяется в носовом смыве у 11% вакцинированных хорьков и 67% животных в группе плацебо, при этом на культуре клеток вирус высевается у 50% животных из группы плацебо и 11% вакцинированных животных. Время элиминации вируса из ВДП вакцинированных хорьков сокращается более чем на 6 сут в сравнении с группой плацебо (см. рис. 4).

Для приматов показано, что на 2-, 4-, 6-, 8-, 10- и 12-е сут после заражения статистически значимых отличий в вирусной нагрузке в мазках из носа для вакцинированных и групп плацебо внутри каждого из двух видов не зарегистрировано. Скорость элиминации коронавируса с поверхности слизистой носа у зеленых мартышек была больше, чем у макак-резусов, как для вакцинированных, так и в группах плацебо. Масса тела приматов после заражения вакцинированных и групп плацебо значимо не изменялась. Однако у приматов каждого вида, Chlorocebus aethiops и Macaca mulatta, в контрольных группах после заражения температура тела регистрировалась на 1 °С выше, чем у вакцинированных животных (рис. 6).

 

Рис. 6. Защитное действие вакцинации ЭпиВакКорона на зеленых мартышках и макаках-резусах по вирусной нагрузке в верхних дыхательных путях, температуре тела и уменьшению массы тела после заражения коронавирусом. Всем животным группы ЭпиВакКорона препарат вводился двукратно внутримышечно в дозе 260 мкг с интервалом 14 сут между инъекциями.

А, Б — вирусная нагрузка, измеренная по значению порогового цикла Ct, в носовом смыве приматов на 2-, 4-, 6-, 8-, 10- и 12-й дни после интраназального заражения коронавирусом: А — Chlorocebus aethiops, Б — Macaca mulatta; В, Г — температура тела у приматов на 2-, 4-, 6-, 8-, 10- и 12-й дни после интраназального заражения коронавирусом: В — Chlorocebus aethiops, Г — Macaca mulatta; Д, Е — изменение массы тела у приматов на 2-, 4-, 6-, 8-, 10- и 12-й дни после интраназального заражения коронавирусом: Д — Chlorocebus aethiops, Е — Macaca mulatta.

 

На 14-е сут после заражения приматов животным делали рентгенограмму с целью контроля появления признаков пневмонии. Все вакцинированные животные были защищены от развития очагово-инфильтративных изменений легких, характерных для вирусных пневмоний. В то же время в группе плацебо после заражения коронавирусом SARS-CoV-2 у 67% приматов каждого вида, Chlorocebus aethiops и Macaca mulatta, были зарегистрированы рентгенологические признаки вирусной пневмонии (рис. 7).

 

Рис. 7. Рентгенограмма органов грудной полости африканской зеленой мартышки в передней проекции через 14 сут после заражения вирусом.

А — невакцинированное животное (стрелками указаны уплотнение легочной ткани неравномерной интенсивности в нижних и средних отделах слева, усиленный легочный рисунок в нижних отделах справа); Б — вакцинированное животное (признаки пневмонии не регистрируются).

 

Есть два основных гистологических признака поражения легких при коронавирусной инфекции — диффузное альвеолярное повреждение и альвеолярно-геморрагический синдром. Оба эти признака присутствуют у животных в настоящем эксперименте, однако в контрольной группе проявляются в гораздо большей степени, чем в группах вакцинированных приматов. Мишени первичного повреждения — альвеолярные пневмоциты 1-го и 2-го типов и эндотелий капилляров (мишень не для вируса). Геморрагический синдром обусловлен тотальным повреждением капилляров альвеолярных перегородок, вследствие этого развиваются тяжелый отек легких (отек высокой проницаемости), артериальная гипоксия и дыхательная недостаточность. Диффузное альвеолярное повреждение предполагает стадийность процесса. Повреждение аэрогематического барьера приводит к внутриальвеолярному отеку, экссудации фибрина с последующим образованием гиалиновых мембран, препятствующих газообмену (экссудативная фаза). В дальнейшем происходят внутриальвеолярный фиброз, организация (склерозирование) пораженной ткани (пролиферативная фаза). У всех вакцинированных животных патологические находки соответствовали начальной стадии фазы пролиферации. В то же время у животных контрольных групп изменения в легких, характерные для пролиферативной фазы, обнаруживались наряду с признаками, характерными для ранней (экссудативной) фазы, что может указывать на продолжающееся патологическое воздействие (рис. 8).

 

Рис. 8. Гистологическое исследование легких приматов, зараженных SARS-CoV-2.

A, В — группа плацебо: А — примат Clorocebus aethiops № 9618. Плотный ателектаз, выраженный отек и воспалительная инфильтрация лимфоидными клетками и нейтрофилами, потеря воздушности сопровождается спазмом сосудов и мелких бронхов, стаз эритроцитов в сосудах микроциркуляторного русла, единичные васкулиты и бронхиолиты, окраска гематоксилином и эозином. Бар указан на снимке; В — примат Clorocebus aethiops № 9628. Гиперемия сосудов, кровоизлияния и плазморрагии в полости альвеол, тромбоз мелких сосудов артериального типа, плазматическое пропитывание стенок кровеносных сосудов, отдельные мелкие очаги фибриноидного некроза, окраска гематоксилином и эозином. Бар указан на снимке. Б, Г — группа ЭпиВакКорона: Б — примат Macaca mulatta № 9643. Небольшой очаг плазмо- и геморрагии в полости альвеол, умеренная лимфоцитарная инфильтрация и отек межальвеолярных перегородок, перифокальная компенсаторная эмфизема, окраска гематоксилином и эозином. Бар указан на снимке; Г — примат Clorocebus aethiops № 9616. Перибронхиально наблюдаются небольшие скопления лимфоцитов, умеренно выраженные эмфизематозные изменения легочной ткани, окраска гематоксилином и эозином. Бар указан на снимке.

 

Полученные нами результаты показывают, что у зеленых мартышек площадь тяжелого поражения меньше (около 25%), чем у макак-резусов (40–45%). В то же время у зеленых мартышек очень ярко проявлялся альвеолярно-геморрагический синдром, особенно у животных контрольной группы. Следует отметить, что массивные периваскулярные, внутрибронхиолярные и интраальвеолярные кровоизлияния, формирование геморрагических инфарктов — признаки ранней фазы патологического процесса. Это очень существенное различие двух моделей приматов, причем отмечалось оно как макроскопически, так и при гистологическом исследовании.

Обсуждение

Вакцина обладает потенциалом для создания коллективного иммунитета, что позволит снизить заболеваемость, предотвратить распространение вируса и уменьшить социальное и экономическое бремя, опо-средованное COVID-19. Хотя разрабатываемая вакцина на основе любой технологической платформы должна удовлетворять требованиям безопасности, у каждого вида препарата могут возникнуть свои ограничения в применении для определенной группы населения (дети, беременные женщины, люди с иммуносупрессивными состояниями). Среди всех разрабатываемых типов вакцин (живые аттенуированные, на основе вирусных векторов, субъединичные и др.) вакцины на основе пептидных антигенов являются одними из самых безопасных. Это обусловлено тем, что на этапе дизайна вакцины исключаются эпитопы, вызывающие антителзависимое усиление инфекции, а также сводятся к минимуму реактогенные или аллергенные эффекты. Недостатком вакцины такого типа может быть ее низкая иммуногенность, однако данная проблема решается применением адъювантов [15].

Разработанная нами вакцина ЭпиВакКорона при двукратном введении с интервалом в 14 дней хомякам, хорькам и низшим приматам (африканским зеленым мартышкам и макакам-резусам) в дозе, равной одной прививочной дозе для человека, вызывает индукцию антител у 100% животных. В опытах на хомяках показано, что вакцинный препарат обладает иммуногенностью. Показано, что вакцина индуцирует ускорение элиминации вируса из верхних дыхательных путей (хорьки) и предотвращает развитие пневмонии у лабораторных животных (хомяки, приматы) после респираторного заражения новым коронавирусом. Рентгенологические исследования легких хомяков и приматов после заражения коронавирусом подтвердили полное отсутствие признаков пневмонии у вакцинированных животных обоих видов. Гистологические исследования ткани легких у хомяков и приматов также показали существенное снижение степени поражения легких вакцинированных животных после интраназального заражения новым коронавирусом.

Вакцина ЭпиВакКорона индуцирует высокие уровни иммунного ответа на антигены пептидной вакцины. Так, значения СГТ антител к антигену вакцины в сыворотке крови хомяков, привитых дозой 260 мкг, через 2 нед после второй прививки составили 1:11943. К этому же сроку у 100% вакцинированных хорьков формируется высокий уровень специфических антител, и СГТ в трех группах хорьков, иммунизированных тремя сериями вакцины ЭпиВакКорона, варьирует в диапазоне 1:9051–1:10159. У приматов вакцина индуцирует антитела в высоких титрах у 100% животных к антигенам вакцины и к цельновирионному антигену коронавируса через 2–3 нед после первой вакцинации. Через 4 нед после первой вакцинации СГТ к антигену вакцины у макак-резусов достигает значения 1:12800, а у зеленых мартышек — 1:11143. 100% животных из экспериментальной группы имели титр антител, специфичных к антигену вакцины, в диапазоне 1:6400–1:25600. При этом после экспериментального заражения вакцинированных животных ни у одного из приматов или хомяков не обнаружено очагово-инфильтративных изменений легких, характерных для вирусных пневмоний, тогда как у испытуемых животных группы плацебо наблюдалась обширная степень поражения легочной ткани и признаки вирусной пневмонии (плеврит, кардиомегалия).

Ускоренная элиминация вируса из ВДП наблюдалась только у вакцинированных хорьков. Возможно, инфицирующие дозы коронавируса, применяемые для привитых приматов и хомяков и равные 10⁶ и 10² инфекционных единиц соответственно, оказались достаточно высокими, чтобы развитие инфекции клеток слизистой ВДП было остановлено системным иммунитетом, индуцированным в результате инъекции пептидной вакцины.

У вакцинированных животных нейтрализующие антитела регистрировались в низких титрах. Однако у 100% зеленых мартышек через 2 нед после вакцинации обнаружены нейтрализующие антитела, титр которых уменьшается через 4 недель после вакцинации. Титры вируснейтрализующих антител (1:40 или более) были обнаружены у большинства иммунизированных хорьков (16 из 18), и у большинства животных наблюдалась сероконверсия на 14-й день после вакцинации. Нейтрализация вируса наблюдалась для сывороток 60% хомяков, иммунизированных 260 мкг ЭпиВакКорона, и для сывороток 50% животных, иммунизированных 86 мкг вакцины. Однако у вакцинированных хомяков регистрировалась 100%-я защита от пневмонии, что также было показано и для обезьян. В экспериментальной модели на хорьках продемонстрирована ускоренная элиминация вируса из ВДП вакцинированных животных. По-видимому, существуют и другие связанные с наличием вирусспецифических антител факторы противовирусной защиты, наблюдаемые у всех вакцинированных животных при высоких титрах. Ненейтрализующие вирусспецифические антитела также способствуют защите посредством опсонизации вирусных частиц и инфицированных клеток и антителозависимой цитотоксичности, включая классический путь активации комплемента и клеточно-опосредованную цитотоксичность.

Вопрос о значимости клеточного и гуморального иммунного ответа и их роли в предотвращении повторного заражения коронавирусом активно изучается. Одним из предположений является то, что для элиминации коронавируса в первую очередь необходим T-клеточный иммунный ответ. Показано, что SARS-CoV-1-специфические Т-клетки памяти сохраняются в периферической крови пациентов до 6–11 лет после инфицирования при отсутствии B-клеток памяти [16, 17]. Было показано, что N-белок SARS-CoV-2, используемый в качестве белка-носителя в вакцине ЭпиВакКорона, содержит большое количество В- и Т-клеточных эпитопов [18–21], а недавно он также был предложен в качестве ценного антигена для вакцин против SARS-CoV-2, разработанных несколькими исследовательскими группами [22, 23]. Таким образом, N-белок, используемый в ЭпиВакКорона, может не только способствовать защите как источник Т-хелперных эпитопов, но и вызывать антигенспецифические CD8⁺ Т-клеточные ответы, что требует дальнейшего изучения. Однако гидроксид алюминия, используемый в качестве адъюванта, и способ иммунизации неоптимальны для стимуляции клеточного иммунного ответа.

Очень важно отметить тот факт, что вакцинированные приматы демонстрировали пониженные, но относительно высокие титры антител (до 1:3200), специфичных к антигену вакцины, через 4 мес после первой иммунизации вакциной ЭпиВакКорона, независимо от того, высокий (1:25600) или минимальные (1:6400) уровни вакциноспецифических антител были достигнуты в первые недели после вакцинации, что указывает на способность пептидной вакцины индуцировать специфические антитела в течение достаточно длительного периода.

Заключение

Проектирование синтетической пептидной вакцины ЭпиВакКорона против нового коронавируса SARS-CoV-2 проводилось на основании информации о первичной структуре белков этого вируса и о структурно-функциональной организации оболочечных белков родственных коронавирусов (SARS, MERS). На этапе проектирования и предварительных скрининговых исследований иммуногенности и протективной активности исследовались пептиды, содержащие функционально значимые и наиболее консервативные участки вирусных белков, которые способны обеспечить устойчивость вакцины к появлению новых антигенно измененных вариантов коронавируса. Часть пептидов была исключена из состава вакцины в связи с потенциально возможным или обнаруженным их иммунопатологическим действием. Для создания полноценного иммунного ответа использовалась схема двойной внутримышечной вакцинации, а гидроксид алюминия применялся в качестве адъюванта. Простота конструкции, содержащей консервативные элементы белков, отсутствие элементов вирусного генома или нативных вирусных белков обеспечивают высокую степень безвредности препарата, формирование иммунного ответа, не чувствительного к антигенному дрейфу коронавируса, а также возможность многократной ревакцинации препаратом ЭпиВакКорона для поддержания защитного уровня противовирусного иммунитета при естественном его ослаблении.

Проведенные исследования показали, что вакцина ЭпиВакКорона обладает выраженной специфической активностью и обеспечивает защиту от заболевания, вызываемого SARS-CoV-2, хомяков, хорьков и нечеловекообразных приматов. Полученные результаты позволяют рассматривать вакцину ЭпиВакКорона как перспективный препарат, способный контролировать распространение нового коронавируса, и можно рекомендовать эту вакцину для проведения клинических исследований.

Дополнительная информация

Участие авторов. Все авторы подтверждают, что они соответствуют критериям авторства ICMJE. Рыжиков А.Б. — руководитель работ, разработчик вакцины, написание статьи; Рыжиков Е.А. — разработчик вакцины, дизайн, синтез и технология получения; Богрянцева М.П. — выпуск и аттестация серии вакцины ЭпиВакКорона для ДКИ; Даниленко Е.Д. — выпуск и аттестация серии вакцины ЭпиВакКорона для ДКИ; Иматдинов И.Р. — дизайн белка-носителя и продуцент; Нечаева Е.А. — выпуск и аттестация серии вакцины ЭпиВакКорона для ДКИ. Пьянков О.В. — вирусологические исследования на культуре клеток, на лабораторных животных; Пьянкова О.Г. — вирусологические исследования; Суслопаров И.М. — технология наработки и очистки белка-носителя; Таранов О.С. — гистологические исследования; Гудымо А.С. — вирусологические исследования на лабораторных животных; Данильченко Н.В. — вирусологические исследования на лабораторных животных; Слепцова Е.С. — технология получения вакцины, иммунологические исследования; Боднев С.А. — молекулярно-биологические исследования; Онхонова Г.С. — технология наработки и очистки белка-носителя; Петров В.Н. — поисково-аналитическая работа, редактирование статьи; Моисеева А.А. — вирусологические исследования; Торжкова П.Ю. — технология наработки и очистки белка-носителя; Пьянков С.А. — иммунологические исследования; Трегубчак Т.В. — молекулярно-биологические исследования, редактирование статьи; Антонец Д.В. — анализ данных экспериментов, статистический анализ, редактирование статьи; Гаврилова Е.В. — дизайн, координация, регулирование исследования; Максютов Р.А. — курирование всех работ по проведению ДКИ.

Источник финансирования. Исследование финансировалось Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзором).

Конфликт интересов. А.Б. Рыжиков, М.П. Богрянцева, Е.Д. Даниленко, И.Р.Иматдинов, Е.А. Нечаева, О.В. Пьянков, О.Г. Пьянкова, И.М. Суслопаров, Е.А. Рыжиков, Е.В. Гаврилова, Р.А. Максютов являются авторами патента RU2738081 на пептидные иммуногены и состав вакцины. Е.С. Слепцова, Е.А.Рыжиков заявляют о трудоустройстве в ООО «ЭпиВак». Все остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Англоязычная версия. Англоязычная версия данной статьи доступна по адресу https://vestnikramn.spr-journal.ru/jour/article/view/1528

Об авторах

Александр Борисович Рыжиков

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: ryzhik@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-7009-0748
SPIN-код: 9282-2863

к.б.н., заведующий отделом

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Евгений Александрович Рыжиков

ООО «ЭпиВак»

Email: e.a.ryzhikov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4233-7870

Директор

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Марина Поликарповна Богрянцева

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: bogryantseva@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-0467-5024
SPIN-код: 5017-6279

к.б.н., заведующая отделом

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Елена Дмитриевна Даниленко

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: danilenko_ed@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5026-1602
SPIN-код: 1388-4127

к.б.н., директор

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Ильназ Рамисович Иматдинов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: imatdinov_ir@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6927-7580
SPIN-код: 8174-1635

к.б.н., ведущий научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Елена Августовна Нечаева

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: nechaeva@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6901-7738
SPIN-код: 9270-8888

к.м.н., заместитель генерального директора

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Олег Викторович Пьянков

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: pyankov@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-3340-8750
SPIN-код: 8622-9293

к.б.н., заведующий отделом

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Ольга Григорьевна Пьянкова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: pyankova_og@vector.nsc.ru
SPIN-код: 5872-2078

Ведущий научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Иван Михайлович Суслопаров

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: imsous@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-9718-7339
SPIN-код: 8371-4785

к.б.н., старший научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Олег Святославович Таранов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: taranov@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6746-8092
SPIN-код: 5894-6518

Заведующий отделом

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Андрей Сергеевич Гудымо

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: gudymo_as@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-6952-6412
SPIN-код: 5274-0265

Младший научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Наталья Викторовна Данильченко

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: danilchenko_nv@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-2655-4629
SPIN-код: 3041-1686

Младший научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Екатерина Сергеевна Слепцова

ООО «ЭпиВак»

Email: katyuss@yandex.ru

Начальник отдела контроля качества

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Сергей Александрович Боднев

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: bodnev@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-0599-3817
SPIN-код: 2219-2723

к.м.н., ведущий научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Галина Сергеевна Онхонова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: onhonova_gs@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-1547-1708
SPIN-код: 2017-8031

Младший научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Владимир Николаевич Петров

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: vnpetrov@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-3270-8412

Заведующий отделом

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Анастасия Алексеевна Моисеева

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: chalaya_aa@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-7048-2357
SPIN-код: 9361-8776

Младший научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Полина Юрьевна Торжкова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: torzhkova_pyu@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-0387-1907
SPIN-код: 8720-8129

Стажер-исследователь

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Степан Александрович Пьянков

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: pyankov_sa@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6593-6614
SPIN-код: 1344-4854

ведущий научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Татьяна Владимировна Трегубчак

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автор, ответственный за переписку.
Email: tregubchak_tv@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-9608-2044
SPIN-код: 1028-1981

Ведущий научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Денис Викторович Антонец

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: antonec@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1823-9701
SPIN-код: 6825-8804

к.б.н., старший научный сотрудник

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Елена Васильевна Гаврилова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: gavrilova_ev@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-7118-5749
SPIN-код: 4523-9695

к.б.н., заместитель генерального директора

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Ринат Амирович Максютов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: maksyutov_ra@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-1314-281X
SPIN-код: 7332-2123

д.б.н., генеральный директор

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Список литературы

Дополнительные файлы