The First Domestic Experience of Detecting the Association of Anaerobic Bacteria Filifactor Alocis and Porphyromonas Gingivalis by Molecular Biological Methods in Periodontal Diseases and Comorbid Pathology (Comparative Research)

Full Text

Обоснование

Воспалительные заболевания пародонта представляют собой наиболее часто встречающуюся патологию: генерализованный пародонтит — тяжелое поражение десен и подлежащих тканей пародонта, которое является шестым по распространенности заболеванием во всем мире среди взрослого работоспособного населения и вторым — среди патологий рта и челюстно-лицевой области после кариеса зубов [1]. Болезни пародонта имеют сложный этиопатогенез и возникают в результате сочетания целого ряда факторов, приводящих к разрушению пародонта, необратимой резорбции костной ткани и потере зубов [2]. Социально-медицинское значение проблемы заболеваний пародонта в последние годы значительно возросло, в том числе из-за увеличившейся частоты локализованного агрессивного пародонтита, развивающегося в молодом возрасте. Проблема пародонтита активно обсуждается на различных конгрессах, проводимых под эгидой ВОЗ, в связи с признанием того факта, что микробное поражение пародонта тесно связано с рядом системных заболеваний и, возможно, играет важную роль в возникновении коморбидной патологии через иммуно-опосредованные механизмы патогенеза [3–5].

Вопрос о роли отдельных видов, входящих в состав орального микробиома, в развитии патологии рта, системном воспалении и возникновении осложнений (сердечно-сосудистой системы, сахарного диабета 2 типа, ревматоидного артрита) активно обсуждается на протяжении последних десятилетий как в зарубежной [3, 4], так и отечественной литературе [5–7]. Возникающие дискуссии связаны в первую очередь с тем, что данная группа вероятных возбудителей относится к облигатно-анаэробным и труднокультивируемым видам, которые сложны для выявления традиционными методами, а также существующими подходами к классификации [7–9].

Первоначально S.S. Socransky et al. в 1998 г. была предложена классификация, основанная на изучении степени частоты определения представителей микрофлоры в очаге воспаления — выделены соответственно «красный», «оранжевый» (наиболее агрессивные) и другие комплексы (в большей степени представляющие нормальную и транзиторную микрофлору — «желтый», «зеленый», «фиолетовый»). В частности, к «красному» комплексу отнесены Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia (по старой номенклатуре — Bacteroides forsythus), а также Treponema denticola [9]. Однако в настоящее время эта классификация имеет больше историческое значение, поскольку некоторые возбудители агрессивного пародонтита, например токсигенный серотип b актинобациллы A. actinomycetemcomitans, были описаны несколько позже [10]. Представители A. actinomycetemcomitans по данной классификации вообще относились к «зеленому» комплексу как представители нормальной микрофлоры, не продуцирующей лейкотоксин (т.е. нетоксигенные серотипы).

В отечественной литературе после I Съезда пародонтологов России, состоявшегося в 2005 г., впервые было введено понятие пародонтопатогенных бактерий I порядка, которые обладают сочетанием трех ведущих признаков, таких как вертикальная и горизонтальная передача от человека к человеку, способность к внутриклеточному паразитизму, а также токсигенность (имеется в виду прежде всего продукция экзотоксинов), в отличие от пародонтопатогенов II порядка, которые не имеют полного набора этих признаков. К пародонтопатогенным видам I порядка соответственно были отнесены три возбудителя — P. gingivalis, T. forsythia и A. actinomycetemcomitans, токсигенный серотип b [5, 6].

В настоящее время, хотя и признается полимикробная природа пародонтита, а воспалительный ответ организма человека на пародонтопатогенные бактерии считается решающим фактором в развитии и прогрессировании заболевания, исследователями введено понятие «ключевой пародонтопатоген», роль которого по всеобщему признанию отводится бактериям вида P. gingivalis из-за их способности модифицировать нормальный состав микробиоты полости рта до более патогенного, что ускоряет потерю костной массы и развитие системных эффектов [5, 8, 11]. Этот пародонтопатоген характеризуется использованием тактик, позволяющих ему ослаблять или обманывать иммунную систему хозяина вследствие обладания очень широким спектром факторов вирулентности, включая протеолитические ферменты (гингипаины), капсулу, эндотоксины, фимбрии, нуклеозиддифосфаткиназу, церамиды [8, 11, 12].

C внедрением технологий метагеномного анализа, секвенирования, масс-спектрометрии появился еще один претендент на роль ключевого пародонтопатогена — Filifactor alocis — грамположительная облигатно-анаэробная бактерия, которая трудно культивируется на искусственных питательных средах и встречается, согласно современным литературным данным, почти исключительно при наличии воспаления тканей пародонта [12]. Вместе с тем этот возбудитель обладает достаточной устойчивостью к оксидативному стрессу [13] и уникальным набором свойств, которые обеспечивают выраженную способность F. alocis к формированию микробных ассоциаций с P. gingivalis и рядом других пародонтопатогенов [14, 15].

Методы, используемые сегодня в клинической практике для диагностики заболеваний пародонта, не позволяют выявить начало воспаления и выделить пациентов, которые предрасположены к прогрессированию заболевания в будущем, а современные диагностические подходы основываются почти исключительно на клинической оценке стоматологического статуса.

В соответствии с последней международной классификацией заболеваний пародонта (2018 г.), поддержанной ВОЗ, принято выделять три степени прогрессирования: А — медленное прогрессирование (нет потери прикрепления десны в течение 5 лет); В — средняя скорость прогрессирования (за 5 лет потеря прикрепления менее 2 мм); С — быстрая скорость прогрессирования (потеря прикрепления более 2 мм за 5 лет) [16, 17]. Такой клинический подход позволяет констатировать степень прогрессирования заболеваний пародонта, но не прогнозировать ее.

В последние годы перспективным для прогноза развития патологии пародонта, как и других инфекционных заболеваний, стали считать исследование микробиома зубодесневой борозды с обнаружением в ее составе бактерий — ключевых пародонтопатогенов P. gingivalis и F. alocis, в том числе с использованием моделирования микробной биопленки оральных симбионтов in vitro [18, 20, 21].

Наиболее перспективен c этой точки зрения молекулярно-генетический метод, позволяющий выявить фрагменты геномов нескольких видов пародонтопатогенов с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Эти молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики стали применяться в различных странах мира на рубеже XXI в. [22–24]. В 2015 г. вышла работа A. Al-Alimi et al. [25], в которой в состав большой группы пародонтопатогенов, тестируемых методом моноплексной, но не мультиплексной ПЦР в реальном времени, входили P. gingivalis и F. alocis.

В связи с этим мы предложили использовать идентификацию одновременно ДНК двух ключевых пародонтопатогенных бактерий F. alocis и P. gingivalis с помощью мультиплексной ПЦР, олигонуклеотидные праймеры и зонды которых имеют отличную от прототипа структуру, что сокращает время исследований и снижает трудозатраты при идентификации бактерий [26]. Кроме того, нами сделана попытка не только идентифицировать указанные виды бактерий при заболеваниях пародонта, но и, используя 16S секвенирование с последующим биоинформационным анализом, установить этиологическую роль этих бактерий при хроническом пародонтите, сочетающемся и не сочетающемся с системным патологическим процессом. В качестве примера системной патологии мы избрали компенсированный сахарный диабет 2 типа.

Цель исследования — применение методов микробиологической генодиагностики и биоинформационного анализа для подтверждения этиологической роли ключевых пародонтопатогенов Filifactor alocis и Porphyromonas gingivalis, характеризующих степень прогрессирования хронического пародонтита и его ассоциации с системным патологическим процессом (сахарным диабетом 2 типа).

Методы

Дизайн исследования

Критерии включения: пациенты в возрасте от 35 до 65 лет с подтвержденным диагнозом «хронический генерализованный пародонтит», в том числе ассоциированный с сахарным диабетом 2 типа в фазе компенсации.

Критерии исключения: курящие пациенты, пациенты с другими видами коморбидной соматической патологии.

Критерии невключения: возрастные группы младше 35 и старше 65 лет, отсутствие подписанного информированного согласия на участие в исследовании.

Гипотеза: определение генетических маркеров пародонтопатогенных бактерий Filifactor alocis и Porphyromonas gingivalis позволяет подтвердить их этиологическое и прогностическое значение в патологии пародонта, в том числе при его сочетании с коморбидной патологией — сахарным диабетом 2 типа.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе ФГБУ ВО Мос-ковский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова (МГМСУ им. А.И. Евдокимова) Минздрава России. Пациенты наблюдались сотрудниками кафедры пародонтологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова (зав. кафедрой — академик РАН, профессор О.О. Янушевич) на протяжении не менее 5 лет. Контрольную группу с интактным (здоровым) пародонтом формировали из пациентов, обращавшихся к стоматологу для проведения профилактической санации полости рта. Пациенты четвертой группы проходили лечение на базе кафедры эндокринологии и диабетологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова (заведующий кафедрой — д.м.н., профессор А.М. Мкртумян) и получали соответствующую консультацию стоматолога. Исследование биоматериала от пациентов проводили на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и в лаборатории молекулярно-биологических исследований Научно-исследовательского медико-стоматологического института (НИМСИ) МГМСУ им. А.И. Евдокимова (директор НИИ, зав. кафедрой — д.м.н., профессор В.Н. Царев).

Продолжительность исследования

Исследование продолжалось с 2019 по 2022 г.

Описание медицинского вмешательства

После объяснения методики диагностического исследования, возможных рисков и преимуществ включения в группу исследования пациенты подписывали соответствующие информированные согласия, а также согласие на персональную обработку данных. Биообразцы материала, взятые у пациентов, исследовали молекулярно-биологическими методами (ПЦР и метагеномномное исследование) с последующим проведением биоинформационного анализа. Все исследования предшествовали проведению лечения пациентов. Лечебных мероприятий, отличных от принятого протокола стоматологического лечения пациентов, не проводили.

В исследование были включены 84 человека, которые обследованы методом мультиплексной ПЦР, в том числе 69 человек — методом 16S секвенирования.

Объекты (участники) исследования

Для исследования методом мультиплексной ПЦР были сформированы четыре группы исследования: первая включала 15 пациентов, у которых хронический пародонтит имел среднюю скорость прогрессирования (степень В); в состав второй группы исследования входили 15 человек с хроническим пародонтитом быстрой скорости прогрессирования (степень С); третья группа служила контролем и содержала 16 условно здоровых людей, не страдающих хроническим пародонтитом (без признаков воспалительных изменений в тканях десны); четверая группа (38 пациентов) включала пациентов, у которых пародонтит был ассоциирован с коморбидной патологией — сахарным диабетом 2 типа. Из состава групп исследования были полностью исключены курящие пациенты, поскольку курение способствует включению F. alocis в состав микробиома слизистой оболочки полости рта даже у субъектов без признаков заболеваний пародонта [19].

Группы обследуемых пациентов включали примерно равное число мужчин и женщин в возрасте 35–65 лет. Стоматологический статус пациентов с хроническим пародонтитом оценивали в соответствии с рекомендациями Международной классификации заболеваний пародонта 2018 г. [17]. В качестве критериев для разграничения средней и быстрой (В и С) степеней прогрессирования заболевания при генерализованном характере поражения служили: В — потеря прикрепления (индекс CAL) за 5 лет менее 2 мм; С — потеря прикрепления за 5 лет 2 мм и более [16, 17].

Исходы исследования

Основной исход исследования. Забор образцов биологического материала проводили утром натощак, исключая использование зубной щетки, антисептических растворов и прочих индивидуальных гигиенических средств. Из четырех наиболее четко клинически выраженных пародонтальных карманов (или зубодесневой борозды моляров при интактном пародонте) стоматологическими аппликаторами № 30 отбирали образцы биопленок, которые помещали в пробирки с крышкой (Eppendorf), содержащие 0,5 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. ДНК выделяли методом ускоренной пробоподготовки с помощью коммерческого набора реагентов «Реалекс» (НПФ «Генлаб», Москва) согласно инструкции.

Для сочетанной идентификации F. alocis и P. gingivalis методом мультиплексной ПЦР на основе последовательностей, находящихся в составе генов 16S рРНК соответствующих бактерий и входящих в базу данных генетических последовательностей GenBank [27], на предварительном этапе исследования были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, получены флуоресцентно меченные зонды для обнаружения в биологическом материале бактерий видов F. alocis и P. gingivalis и сформирован набор реагентов для воспроизведения мультиплексной ПЦР [26].

Анализ и интерпретацию результатов проводили с помощью программного обеспечения прибора CFX 96 (Bio-Rad, США). Детекцию осуществляли по каналам ROX, HEX и Cy5. По каналу ROX идентифицировали образцы, содержащие ДНК P. gingivalis, по каналу HEX — ДНК F. alocis при наличии положительной реакции по каналу Cy5 (внутренний положительный контроль забора биологического материала — ДНК человека).

Для выделения из образцов поддесневой биопленки чистых культур анаэробов пародонтопатогенной группы использовали анаэростаты Himedia Labs (Индия) с вакуум-насосом, обеспечивающим замену атмосферного воздуха на стандартную газовую смесь, включающую азот (N₂) — 80%, углекислый газ (CO₂) — 10% и водород (Н₂) — 10%. Посевы проводили на кровяном агаре, приготовленном на основе сердечно-мозгового агара со стандартными питательными добавками — гемином и менадионом (Himedia Labs, Индия). Для культивирования F. alocis добавляли набор необходимых аминокислот — L-цистеин, аргинин. Моделирование адгезии ассоциации оральной микробиоты осуществляли в чашках Петри с сердечно-мозговым бульоном (с теми же питательными добавкам) на подложке из метаметилакрилата («ВладМива», Россия) в орбитальном шейкер-инкубаторе ES-20 (BioSan, Латвия), совершающем качательные движения. В соответствии с патентованной методикой срок инкубации составлял 7 сут при температуре 37 °С в анаэробных условиях (микроанаэростат) [21]. Оценку адгезированных клеток возбудителей (клинических изолятов), в том числе на начальном этапе формирования биопленки, проводили при окраске генцианвиолетом на исследовательском микроскопе с системой цифровой видеорегистрации Eclipse (Nikon, Япония).

Анализ в подгруппах

По результатам проведенной мультиплексной ПЦР с разработанными олигонуклеотидными праймерами для выявления в биологическом материале представителей пародонтопатогенных видов F. alocis и P. gingivalis проводили сравнительный анализ по частоте положительных реакций с последующим построением ROC-кривых. Кроме того, для выявления соответствия между частотой встречаемости F. alocis и P. gingivalis и развитием системных эффектов болезней пародонта выполнялось 16S секвенирование методом дробовика в трех группах исследования — у клинически здоровых людей, у пациентов с хроническим пародонтитом степени С и у пациентов с хроническим пародонтитом степени С, ассоциированным с коморбидной патологией — компенсированным сахарным диабетом 2 типа. У всех пациентов без сахарного диабета уровень гликированного гемоглобина (HbA1) был менее 6,0%.

Метод регистрации исходов

Для выполнения исследований из образцов биологического материала в рамках каждой группы исследования готовили смешанные пулы ДНК, включающие равные молярные количества геномной ДНК каждого пациента. Смешанные пулы ДНК подвергались обогащению с помощью системы Nebnext в соответствии с инструкциями производителя. Далее осуществлялось ультразвуковое фрагментирование микробной ДНК с использованием системы Covaris S220 (США) и последующим определением размера фрагментов на биоанализаторе Agilent 2100 (США) согласно инструкции производителя. Следующим этапом служило секвенирование полированных образцов на генетическом анализаторе MiSeq (Illumina) по инструкциям производителя.

Этическая экспертиза

Состав исследуемых групп и план их обследования утверждены межвузовским этическим комитетом г. Москвы (протокол № 13-20 от 2019 г.), все участники исследования подписали информированное согласие на обработку персональных данных.

Статистический анализ

Таксономический анализ данных, полученных при секвенировании гена 16S рибосомальной РНК в составе пулированных образцов с определением родовой принадлежности бактерий, входящих в состав микробиома, выполнялся с использованием биоинформационных систем QIIME2 (Quantitative Insights into Microbial Ecology) [28] и SILVA [29]. Статистическая обработка полученных данных включала тест PERMANOVA для микробных сообществ [30] в сочетании с эволюционной моделью PhiLR [31] и выявлением биомаркеров отдельных групп исследования на основе множественной логистической регрессии.

Результаты

Основные результаты исследования

Первым фрагментом исследования являлось формирование базы данных из числа обследованных пациентов групп сравнения по результатам проведения мультиплексной ПЦР. Частота встречаемости F. alocis, P. gingivalis и ассоциации этих бактерий в группах больных хроническим пародонтитом степеней В и С и в контроле представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Частота встречаемости F. alocis, P. gingivalis и ассоциации этих бактерий в группах больных хроническим пародонтитом и в контроле

 

Частота обнаружения F. alocis при хроническом пародонтите степени В составила 87%, в то время как у здоровых людей эти бактерии не регистрировали. При хроническом пародонтите степени С наличие F. alocis было отмечено во всех случаях (100%). Частота встречаемости P. gingivalis при хроническом пародонтите степени В составляла 40% и была достоверно (в 2,2 раза) ниже, чем F. alocis. При хроническом пародонтите степени С частота регистрации P. gingivalis на уровне 93% статистически достоверно не отличалась от таковой для F. alocis. У здоровых людей P. gingivalis обнаруживались в 19% случаев, что было статистически достоверно ниже по сравнению с больными хроническим пародонтитом, в том числе сочетанным с сахарным диабетом 2 типа.

Особо следует подчеркнуть, что одновременное наличие P. gingivalis и F. alocis при хроническом пародонтите степени В было отмечено в 20% случаев, т.е. достоверно реже (соответственно в 4,4 и в 2 раза), чем для каждого из тестированных пародонтопатогенов в отдельности, хотя у больных хроническим пародонтитом степени С частота встречаемости обоих пародонтопатогенов при использовании мультиплексной ПЦР оставалась на том же высоком уровне — в 93% случаев. Не отмечено одновременного наличия обоих пародонтопатогенов у здоровых людей.

Таким образом, апробация оригинальных тест-систем для идентификации P. gingivalis и F. alocis методом мультиплексной ПЦР показала возможность их использования для дифференцированного подхода к диагностике хронического пародонтита степеней В и С.

Для подтверждения диагностического значения теста в каждом конкретном случае проводили построение ROC-кривых, характеризующих линейную регрессию между чувствительностью и специфичностью теста в первой и второй группах пациентов при сравнении с контролем. Результаты построения ROC-кривых с определением критерия их количественной оценки в виде площади под ROC-кривой (AUC) показаны на рис. 2.

 

Рис. 2. ROC-кривые диагностической значимости результатов мультиплексной ПЦР при хроническом пародонтите степени В (А) и степени С (Б)

 

Диагностическое значение определения F. alocis для оценки степени прогрессирования хронического пародонтита с помощью мультиплексной ПЦР по данным построения ROC-кривой, в отличие от P. gingivalis, было максимально высоким (AUC 0,9–1,0) независимо от быстроты прогрессирования хронического пародонтита.

Построение ROC-кривых для определения диагностической значимости обнаружения P. gingivalis в биологическом материале из зубодесневой борозды показало, что у больных хроническим пародонтитом степени В при сравнении с контролем величина AUC составляла 0,6, т.е. не соответствовала высокой диагностической значимости. При хроническом пародонтите степени С AUC в результате построения ROC-кривой по величине (0,873) соответствовала высокой диагностической значимости.

Наконец построение ROC-кривых для ассоциации P. gingivalis и F. alocis при хроническом пародонтите степени В в сравнении с контролем также не подтвердило высокой диагностической значимости (AUC = 0,6), а при хроническом пародонтите степени С AUC не только оценена как очень высокая (0,932), но и в условиях наших исследований была максимальной.

Учитывая практически неизученную способность F. alocis к развитию системных эффектов, сопутствующих заболеваниям пародонта, мы воспользовались данными 16S секвенирования. С использованием сочетания кластерного и регрессионного анализа в ходе биоинформационной обработки полученных данных выявлено шесть категорий дифференциальных межгрупповых признаков (балансов), позволяющих дифференцировать группы исследования, как это представлено в нижней части рис. 3. Наибольшую информативность проявляли баланс D, эффективно выявлявший различия между группой здоровых людей и пациентов с хроническим пародонтитом, и баланс F для сравнения групп пациентов с хроническим пародонтитом, ассоциированным и не ассоциированным с сахарным диабетом 2 типа.

 

Рис. 3. Таксономические балансы микробиомов зубодесневой борозды при сравнении групп исследования

 

Подобный подход к биоинформационному анализу данных, полученных в ходе 16S секвенирования образцов микробной биопленки полости рта, позволил не только определить преобладающие виды пародонтопатогенов, но и установить степень их участия в формировании биопленки в разных клинических группах. Так, в группе здоровых лиц среди зарегистрированного набора пародонтопатогенов наиболее часто наблюдалось представительство бактерий рода Fusobacterium. В группе пациентов с хроническим пародонтитом эти бактерии в значительной степени вытеснялись представителями родов Treponema, Mycoplasma и особенно Filifactor. При ассоциации хронического пародонтита с сахарным диабетом 2 типа опять происходило изменение в представительстве отдельных видов пародонтопатогенов и на первое место по уровню регистрации выходили бактерии родов Porphyromonas и Prevotella.

Представленная схема смены возбудителей по мере развития хронического генерализованного пародонтита и сопутствующих ему системных патологических процессов совершенно не исключает возможности вхождения бактерий других таксономических групп в состав микробиома при исследованных патологических состояниях. Тем не менее, поскольку в каждой клинической группе нами исследовалось от трех до четырех пулированных образцов материала из зубодесневой борозды и была отмечена повторяемость результатов, мы сочли вполне правомочным выдвижение гипотезы о возможности смены доминирующих представителей пародонтопатогенных бактерий, включающих представителей родов Filifactor и Porphyromonas, как при развитии, так и при изменении характера патологического процесса.

Дополнительные результаты исследования

Обсуждая таксономию нового пародонтопатогена, нужно отметить, что по старой номенклатуре F. alocis относили к роду фузобактерий (Fusobacterium alocis) [6], и, вероятно, поэтому он как филогенетически близкий симбионт подобно фузобактериям принимает активное участие в формировании каркаса поддесневой микробной биопленки, к которому далее прикрепляются другие виды пародонтопатогенных бактерий. Особого внимания заслуживает выявленная в некоторых первых исследованиях способность F. alocis формировать переплетающиеся нитевидные элементы, откуда и происходит его первоначальное название «производитель нитей десневой борозды» (лат.) [6, 13, 14].

В наших исследованиях при культивировании на 5%-м кровяном сердечно-мозговом агаре в анаэробных условиях с добавлением стимуляторов роста (L-цистеина, аргинина) F. alocis давал прозрачные, опалесцирующие, мелкие выпуклые колонии, микроскопически представленные нитевидными грамположительными формами (рис. 4). При моделировании трехвидовой микробной биопленки из представителей оральной микробиоты в биокультиваторе на метилметакрилатной подложке в сердечно-мозговом бульоне [21] мы наблюдали образование нитевидных структур, которые можно расценивать как основу формирования биопленки (рис. 5). При моделировании биопленки на стадии коагрегации при иммерсионном увеличении микроскопа определяются нити, образуемые F. alocis, и адгезированные элементы Streptococcus sanguis, P. gingivalis.

 

Рис. 4. Filifactor alocis. Мазок из чистой культуры. Увеличение ×100, иммерсионный объектив. Окраска по Граму

 

Рис. 5. Filifactor alocis. Моделирование биопленки (коаггрегация с оральной микробиотой). Увеличение ×100, иммерсионный объектив. Окраска — генцианвиолет

 

Нежелательные явления

В процессе исследования нежелательных явлений в результате проводимых манипуляций, связанных со взятием биологического материала, у пациентов не отмечено.

Обсуждение

Изучение микробиома организма человека и разработка современных методов исследования, в том числе молекулярно-биологических и биоинформационных, — актуальные проблемы современной медицинской науки [32, 33]. В условиях санкционного режима, проводимого США и странами Евросоюза, особую важность представляют разработка и внедрение в практику клинической лабораторной диагностики отечественных молекулярно-биологических диагностических систем [34].

В соответствии с целью настоящего исследования с использованием методов микробиологической генодиагностики мы проводили анализ возможной этиологической и прогностической роли генетических маркеров ключевых пародонтопатогенов F. alocis и P. gingivalis и оценку их взаимосвязи с системным патологическим процессом — сахарным диабетом 2 типа. Для идентификации в поддесневой биопленке указанных ключевых пародонтопатогенов, предположительно характеризующих степень прогрессирования пародонтита, особого обсуждения заслуживает как целесообразность выполнения этих исследований, так и возможность использования для этого предложенной авторами отечественной тест-системы для проведения мультиплексной ПЦР. Этиологическая роль P. gingivalis как ключевого пародонтопатогенного вида, способного модифицировать нормальный состав микробиоты полости рта до более агрессивного и участвовать в развитии системных эффектов заболеваний пародонта, в настоящее время сомнению не подвергается [2, 5, 7, 19].

Что касается патогенетического значения F. alocis как труднокультивируемого патогена, который относительно недавно был отнесен к пародонтопатогенным видам I порядка, то его значение в данном аспекте продолжает оставаться малоизученным. Вместе с тем в настоящее время известно, что обнаружение F. alocis в биоматериале поддесневой биопленки указывает на сильную корреляцию с заболеваниями пародонта и практически не регистрируется у здоровых людей [11, 35].

Вследствие выраженной протеазной активности и способности к участию в метаболизме аргинина F. alocis не только колонизирует пародонтальные ткани, но и непосредственно влияет на формирование сообщества пародонтопатогенных микроорганизмов [36]. При этом наиболее выраженный синергизм проявляется при взаимодействии F. alocis с ключевым пародонтопатогеном P. gingivalis, а сочетание этих возбудителей взаимно повышает инвазивные свойства и значительно усиливает процессы формирования биопленки в целом [18, 19], что и побудило нас к созданию праймеров и зондов для мультиплексной ПЦР на основе ассоциации названных пародонтопатогенов [26].

Кроме того, как подчеркивается в одной из публикаций последних лет E. Aja et al. [37], F. alocis выступает новым важным компонентом микробиома пародонта, и в авторы предлагают использовать его в качестве характерного маркера заболеваний пародонта. Однако из-за отсутствия генетических инструментов для изучения этого микроорганизма о его характеристиках вирулентности мало известно. Именно с этой точки зрения предлагаемая нами тест-система для генодиагностики заболеваний пародонта и подтверждение ее диагностической значимости открывают новые перспективы для исследования этой категории патологических состояний с выраженными системными эффектами.

Роль P. gingivalis в патогенезе широкого спектра системных патологических процессов изучена довольно хорошо [6, 7, 36], при этом как в клинике, так и в эксперименте подчеркивается роль этих бактерий в патогенезе сахарного диабета 2 типа и атеросклероза [38]. В то же время этиопатогенетическое значение F. alocis, особенно в развитии системных эффектов, в научной литературе описано весьма скудно [18, 37], в частности, на уровне образования внеклеточных везикул при ассоциации заболеваний пародонта и остеопороза [39]. Других указаний на роль F. alocis в развитии системных эффектов в настоящее время в доступной литературе мы не встретили.

В данном исследовании для определения взаимосвязи между изучаемыми ключевыми пародонтопатогенами и развитием системных эффектов было использовано 16S секвенирование с последующим биоинформационным анализом, который подтвердил, что развитие системной патологии в виде сахарного диабета 2 типа сопровождалось снижением значения бактерий рода Fillfactor и возрастанием ключевой роли бактерий рода Porphyromonas.

Ограничения в исследовании

В настоящее время не вызывает сомнений, что существует взаимосвязь между заболеваниями пародонта и коморбидной патологией, в данном случае для пародонтита, ассоциированного с сахарным диабетом 2 типа. Однако возникает вопрос: насколько специфичны для системной патологии или, наоборот, универсальны эти мишени? Рабочая гипотеза состоит в том, что соответствие локальной и системной патологии несет в себе как общие закономерности, так и специфические признаки конкретной системной патологии, что в итоге определяет возможность прогнозирования развития основного заболевания. Проверка этой гипотезы на модели взаимосвязи пародонтопатогенных бактерий с сахарным диабетом 2 типа может быть детализирована для других пародонтопатогенных видов с применением использованных в нашем исследовании методик молекулярно-биологической диагностики.

Заключение

Одним из актуальных направлений пародонтологии и связанных с ней системных заболеваний является исследование этиологической роли ассоциации пародонтопатогенных бактерий Filifactor alocis и Porphyromonas gingivalis. Полученные результаты позволяют обосновать комплексный подход к использованию результатов микробиологических методов, включающих генодиагностику, 16S секвенирование и последующий биоинформационный анализ.

Расшифровка молекулярно-генетических механизмов взаимного влияния этих бактерий, оценка патогенетического и диагностического значения для формирования названной ассоциации требуют специального методического обеспечения. С этой целью нами предложена тест-система, предназначенная для идентификации F. alocis и P. gingivalis методом мультиплексной ПЦР, и показана ее диагностическая эффективность при хроническом пародонтите различной степени тяжести.

Параллельно методом 16S секвенирования с последующим биоинформационным анализом на модели хронического пародонтита, сочетанного с сахарным диабетом 2 типа, как системной коморбидной патологии показано, что представители рода Filifactor играют существенную этиологическую роль в развитии хронического пародонтита, но при ассоциации этого заболевания с системной патологией ведущая ключевая роль переходит к представителям рода Porphyromonas.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках Государственного задания № 056-00035-21-00 от 17 декабря 2020 г. Рукопись подготовлена и публикуется за счет финансирования по месту работы авторов. В работе была использована инфраструктура Уникальной научной установки «Трансгенбанк».

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. О.О. Янушевич — дизайн исследования, организация групп пациентов и сбора биоматериала, прочтение и направление рукописи на публикацию (разделил ответственность за изложенные данные с коллективом авторов); В.Н. Царев — дизайн исследования, проведение микробиологических и молекулярно-генетических исследований биоматериала, анализ полученных данных, написание статьи; Е.Н. Николаева — проведение микробиологических и молекулярно-генетических исследований биоматериала, анализ полученных данных, написание статьи; И.П. Балмасова — проведение молекулярно-генетических исследований биоматериала, биоинформационный и статистический анализ, написание статьи; Е.В. Ипполитов — сбор биоматериала, пробоподготовка, анализ полученных данных; Т.В. Царева — сбор биоматериала, проведение молекулярно-генетических исследований биоматериала, биоинформационный анализ; М.С. Подпорин — сбор биоматериала, статистический анализ; А.Г. Пономарева — анализ результатов, прочтение и одобрение рукописи для публикации (разделила ответственность за изложенные данные с коллективом авторов). Все авторы внесли значимый вклад в подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию текста перед публикацией.

About the authors

Oleg O. Yanushevich

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: rectorat.mgmsu@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0059-4980
SPIN-code: 1452-1387

MD, PhD, Professor, Academician of the RAS

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya str., 127473, Moscow

Viktor N. Tsarev

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Author for correspondence.
Email: nikola777@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-3311-0367
SPIN-code: 8180-4941

MD, PhD, Professor

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya str., 127473, Moscow

Elena N. Nikolaeva

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: el.nikolaeva@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-7854-3262
SPIN-code: 9150-4102

MD, PhD, Professor, Chief Scientific Officer

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya str., 127473, Moscow

Irina P. Balmasova

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: iri.balm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8194-2419
SPIN-code: 8025-8611

MD, PhD, Professor

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya str., 127473, Moscow

Evgeny V. Ippolitov

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: ippo@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-1737-0887
SPIN-code: 3002-7360

MD, PhD, Professor

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya str., 127473, Moscow

Tatiana V. Tsareva

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: tancha-leo84@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9571-0520
SPIN-code: 2028-8404

MD, PhD, Assistant Professor

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya str., 127473, Moscow

Mikhail S. Podporin

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: podporin.mikhail@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6785-0016
SPIN-code: 1937-4996

MD, PhD, Research Associate

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya str., 127473, Moscow

Anna G. Ponomareva

A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: lara12346@yandex.ru
SPIN-code: 3930-5307

MD, PhD, Professor

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya str., 127473, Moscow

References

Supplementary files