Background: Breast tumors are number one cause of cancer morbidity and mortality among women around the world, and Russia is not an exception. Many proteins that control proliferation of immortalized cells are redox-regulated, which is essential for modulating cellular proliferative activity, especially during tumor growth. Studying the role of glutaredoxin and glutathione in cell cycle phase distribution will allow not only to identify the molecular targets regulating cell proliferation, but also to develop methods of diagnosis and targeted therapy of socially sensitive diseases, including breast cancer, in the future.
Aims: To evaluate the role of glutathione and glutaredoxin in the molecular mechanisms regulating MCF-7 breast cancer cell proliferation under the effects of roscovitine, a cyclin-dependent protein kinase inhibitor.
Materials and methods: The MCF-7 cell line (human breast adenocarcinoma) was used in the study. The cell culture was incubated in the presence and absence of roscovitine in the final concentration of 20 µmol for 18 h. The production of reactive oxygen species, the distribution of cells between cell cycle phases and the amount of Annexin V positive cells were determined using flow cytometry. The concentrations of total, reduced and oxidized glutathione, protein SH groups and protein-bound glutathione were measured by spectrophotometry. The levels of glutaredoxin, cyclin E and cyclin-dependent protein kinases were estimated by Western blotting with monoclonal antibodies.
Results: The effects of roscovitine in the MCF-7 cells resulted in cell cycle arrest in G2/М phases with the decreased levels of cyclin E and cyclin-dependent protein kinase 2. It was accompanied by activation of programmed cell death. In tumor cells incubated in the presence of roscovitine, oxidative stress was triggered, which was accompanied by the elevated generation of reactive oxygen species, the decrease in the concentration of reduced glutathione, and the rise in the level of glutaredoxin. It contributed to the increase in protein glutathionylation against the backdrop of the decreased SH group concentration.
Conclusions: Breast cancer cell proliferation under the effects of roscovitine is reduced following not only the decrease in the cyclin level and cyclin-dependent protein kinase activity, but also the shift in the intracellular oxidant/antioxidant ratio. Roscovitine-induced oxidative stress in the MCF-7 cells contributed to protein glutathionylation with the changes in the protein structure and functions. It results in impaired cell cycle progression, indicating a possibility to regulate cellular proliferation through modulating functional properties of redox-dependent proteins using the glutathione/glutaredoxin system.
Обоснование. Опухоли молочной железы занимают первое место в структуре онкологической заболеваемости и смертности среди женщин в мире, в том числе и в России. Многие белки, контролирующие пролиферацию иммортализированных клеток, являются редоксрегулируемыми, что играет важную роль в модуляции пролиферативной активности клеток, особенно при опухолевом росте. Исследование вклада глутаредоксина и глутатиона в распределение клеток по фазам клеточного цикла позволит не только определить молекулярные мишени регуляции пролиферации, но и в перспективе разработать методы таргетной терапии и диагностики социально-значимых заболеваний, в том числе рака молочной железы. Цель исследования — оценить роль глутатиона и глутаредоксина в молекулярных механизмах регуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы линии МСF-7 при действии росковитина — ингибитора циклинзависимых протеинкиназ.
Методы. Исследование выполнено с использованием культуры клеток аденокарциномы молочной железы линии МСF-7, инкубируемых в присутствии и отсутствии росковитина в конечной концентрации 20 мкМ в течение 18 ч. С помощью проточной цитофлуориметрии определяли продукцию активных форм кислорода, распределение клеток по фазам клеточного цикла и количество аннексинположительных клеток. Концентрацию общего, восстановленного и окисленного глутатиона, SH-групп протеинов и белковосвязанного глутатиона определяли спектрофотометрическим методом. Содержание глутаредоксина, циклина Е и циклинзависимых протеинкиназ оценивали с помощью специфических моноклональных антител методом вестерн-блоттинга.
Результаты. Установлено, что при действии росковитина в клетках линии MCF-7 происходила остановка клеточного цикла в G2/М фазах при снижении содержания циклина Е и циклинзависимой протеинкиназы 2, что сопровождалось активацией программированной гибели клеток. В опухолевых клетках, инкубированных в присутствии росковитина, активировался окислительный стресс, сопровождающийся повышенной генерацией активных форм кислорода, снижением концентрации восстановленного глутатиона и повышением содержания глутаредоксина, что способствовало увеличению глутатионилирования белков на фоне снижения концентрации SH-групп протеинов.
Заключение. Пролиферация клеток аденокарциномы молочной железы при действии росковитина снижается не только вследствие уменьшения содержания циклинов и активности циклинзависимых протеинкиназ, но и в результате изменения соотношения про- и антиоксидантов внутри клетки. Глутатион и глутаредоксин, участвуя в реакциях глутатионилирования/деглутатионилирования белков в клетках линии MCF-7 при индуцированном росковитином окислительном стрессе, способствовали модуляции функциональных свойств протенов, что привело к нарушению прогрессии фаз клеточного цикла, указывая на возможность редокс-регуляции пролиферации.