Annals of the Russian academy of medical sciencesAnnals of the Russian academy of medical sciencesВестник Российской академии медицинских наук0869-60472414-3545"Paediatrician" Publishers LLC58410.15690/vramn584INFECTIOUS DISEASES: CURRENT ISSUESАКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙAssessment of Protective Properties of the Recombinant Complex of the Outer Membrane Protein F and the Toxoid of Pseudomonas aeruginosaИсследование протективных свойств рекомбинантного комплекса белка F наружной мембраны и анатоксина Pseudomonas aeruginosaKaloshinA. A.КалошинАлексей Алексеевич
Russian Federation

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории протективных антигенов

alex-k-1973@yandex.ruLeonovaE. I.ЛеоноваЕвгения Игоревна
Russian Federation

assistance researcher

младший научный сотрудник лаборатории протективных антигенов

evgeniya-leonova@mail.ruSoldatenkovaA. V.СолдатенковаАлена Владимировна
Russian Federation

научный сотрудник лаборатории протективных антигенов

lesic7@yandex.ruMikhaylovaN. A.МихайловаНаталья Александровна
Russian Federation

MD, PhD, Professor

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией протективных антигенов, заместитель директора по научной работе

n_michailova@inbox.ruMechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, MoscowНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва240320167115101712201517122015Copyright ©; 2016, "Paediatrician" Publishers LLCCopyright ©; 2016, Издательство "Педиатръ"2016"Paediatrician" Publishers LLCИздательство "Педиатръ"https://vestnikramn.spr-journal.ru/jour/article/view/584

Pseudomonas aeruginosa induces the complications after burns, injuries, surgical interventions and appears to be one of the main causative agents of nosocomial infections. This pathogen has the high resistance to the antibacterial preparations, therefore the immunoprophylaxis is considered as one of the major approaches to reduce Pseudomonas infection. Objective: The aim of our investigation is to study the protective properties of the recombinant complex of the outer membrane protein F (OprF) and a non-toxic variant of the exotoxin A (toxoid) against Pseudomonas infection. Methods: The recombinant proteins which contained the additional histidine residues were synthesized into Escherichia coli with isopropyl-βD-thyogalactopyranoside (IPTG). The recombinant proteins were purified by affinity chromatography on Ni-Sepharose. The preparations of recombinant proteins were injected intraperitoneally into the mice. Aluminum hydroxide was used as an adjuvant. For an experimental infection in mice, animals were challenged intraperitoneally by a live virulent culture of P. aeruginosa (PA-103 strain). Results: The best protective effect for the complex containing 25 μg OprF and 50 μg toxoid was identified when we used the double immunization of mice (Index of efficiency of the protective properties in this case was 4.0). Indexes of efficiency of separated recombinant proteins which were injected twice in the same doses were 2.0 for OprF и 2.3 for toxoid. The triple immunization of animals was inefficient for separated recombinant proteins in the same doses. The injection of doses which were lowered twice (12.5 μg for OprF and 25 μg for toxoid) resulted in increased survival of mice immunized by individual proteins (indexes of efficiency: 3 for OprF and и 3,5 for toxoid). However when we administered to the complex of proteins with the same doses Index of efficiency was 2.8. Conclusion: It was shown that the maximum protective effect in a short time is achieved by the combination of double immunization and the mixture of the recombinant proteins OprF and the 25 and 50 μg doses of recombinant toxoid .

Pseudomonas aeruginosa вызывает осложнения после ожогов, травм и хирургических вмешательств, являясь одной из основных причин нозокомиальных инфекций. Этот патоген обладает высокой резистентностью к большинству антибактериальных средств, поэтому иммунопрофилактика рассматриваться как один из приоритетных подходов для борьбы с синегнойной инфекцией. Цель исследования: Изучить защитные свойства рекомбинантного комплекса белка F наружной мембраны (OprF) и атоксической формы экзотоксина А (анатоксина) от экспериментальной синегнойной инфекции. Методы: Рекомбинантные белки, содержащие дополнительную шести гистидиновую последовательность, синтезировали в клетках Escherichia coli c помощью изопропил-b-d-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и очищали методом аффинной хроматографии с использованием Ni-сефарозы. Препаратами рекомбинантных белков внутрибрюшинно иммунизировали мышей. В качестве адъюванта использовали гидроксид алюминия. Экспериментальное заражение осуществляли внутрибрюшинным введением живой вирулентной культуры P. aeruginosa штамма РА103. Результаты: При двукратной иммунизации мышей комплексом, содержащим 25 мкг OprF и 50 мкг анатоксина, выявлен наилучший протективный эффект (индекс эффективности защитных свойств в этом случае составил 4,0). Индексы эффективности для рекомбинантных белков, вводимых двукратно в тех же дозах по отдельности, соответствовали 2,0 для OprF и 2,3 для анатоксина и не увеличивались после трехкратной иммунизации животных. Уменьшенные в два раза доз (12,5 мкг OprF и 25 мкг анатоксина) при трехкратном введении способствовало увеличению выживаемости мышей иммунизированных отдельными белками (индексы эффективности: 3 для OprF и 3,5 для анатоксина), однако при введении комплекса белков в тех же дозах индекс эффективности не увеличивался и составил 2,8. Заключение: Показано, что максимальный протективный эффект формируется в короткие сроки при использовании комплексной иммунизации двумя рекомбинантными белками OprF и анатоксином в дозах 25 и 50 мкг.

Pseudomonas aeruginosaouter membrane protein F (OprF)exotoxin AtoxoidPseudomonas aeruginosaбелок F наружной мембраны (OprF)экзотоксин Аанатоксин.Программа фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий» на 2014 год1. Falagas ME, Koletsi PK, Bliziotis IA. The diversity of definitions of multidrug-resistant (MDR) and pandrug-resistant (PDR) Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. J Med Microbiol. 2006;55(12):1619–1629. doi: 10.1099/jmm.0.46747-02. Strateva T, Yordanov D. Pseudomonas aeruginosa ― a phenomenon of bacterial resistance. J Med Microbiol. 2009;58(9):1133–1148. doi: 10.1099/jmm.0.009142-0.3. Бобровничий В.И. Современные подходы к диагностике и лечению синегнойной инфекции у больных муковисцидозом // Медицинский журнал. – 2012. – No1. – С. 4–9. [Bobrovnichii VI. Modern approaches to diagnosis and treatment of Pseudomonas aeruginosa infection in a patient with cystic fibrosis. Meditsinskii zhurnal. 2012;1:4–9. (In Russ).]4. Мороз А.Ф. Применение поливалентной вакцины с защитным эффектом против Pseudomonas aeruginosa / Сб. материалов Всесоюзной конференции по ранам и раневой инфекции. – М.; 1977. С. 73–74. [Moroz AF. Primenenie polivalentnoi vaktsiny s zashchitnym effektom protiv Pseudomonas aeruginosa. (Conference proceedings) Sb. materialov Vsesoyuznoi konferentsii po ranam i ranevoi infektsii. Moscow; 1977. p. 73–74. (In Russ).]5. Станиславский Е.С. и др. Бесклеточная псевдомонас-вакцина. Лабораторные испытания эффективности экспериментальных псевдомонас-вакцин // Журнaл микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 1982. – No10. – С. 25–29. [Stanislavskii ES, et al. Beskletochnaya psevdomonas-vaktsina. Laboratornye ispytaniya effektivnosti eksperimental’nykh psevdomonas-vaktsin. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. 1982;10:25–29. (In Russ).]6. Макаренко Т.А., Станиславский Е.С. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa // Журнaл микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 1996. – No2. – С. 7–9. [Makarenko TA, Stanislavskii ES. Immunologicheskoe izuchenie belkov kletochnoi stenki Pseudomonas aeruginosa. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. 1996;2:7–9. (In Russ).]7. Kim DK, Kim JJ, Kim JH, et al. Comparison of two immunization schedules for a Pseudomonas aeruginosa outer membrane proteins vaccine in burn patients. Vaccine. 2000;19(9–10):1274–1283. doi:10.1016/S0264-410X(00)00235-88. Krishnan S, Prasadarao NV. Outer membrane protein A and OprF ― Versatile roles in Gramnegative bacterial infections. FEBS Journal. 2012;279(6):919–931. doi: 10.1111/j.1742-4658.2012.08482.x.9. Калошин А.А., Гатыпова Е.В., Михайлова Н.А. Получение рекомбинантных форм белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммуногенных свойств // Биотехнология. – 2011. – No2. – С. 74–84. [Kaloshin AA, Gatypova EV, Mikhailova NA. Obtaining of Recombinant Forms of Outer Membrane Protein F from Pseudomonas aeruginosa and Assessment of their Immunogenic Properties. Biotekhnologiia (Mosc.). 2011;2:74–84. (In Russ).]10. Вертиев Ю.В., Бродвинова Н.С., Мороз A.Ф. Экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa и его роль в патогенезе синегнойной инфекции // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. – 1981. – No2. – С. 13–19. [Vertiev YV, Brodvinova NS, Moroz AF. Ekzotoksin A Pseudomonas aeruginosa i ego rol’ v patogeneze sinegnoinoi infektsii. Zhurnal mikrobiologii epidemiologii i immunologii. 1981;2:13–19. (In Russ).]11. Калошин А.А., Исаков М.А., Михайлова Н.А., Вертиев Ю.В. Получение рекомбинантной атоксической формы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 154. – No9. – С. 330–335. [Kaloshin AA, Isakov MA, Mikhailova NA, Vertiev JV. Preparation of Recombinant Atoxic Form of Exotoxin A from Pseudomonas Aeruginosa. Bull Exp Biol Med. 2013;154(3):346-350.] doi: 10.1007/ s10517-013-1947-112. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. – Л.: Медицинская литература; 1962. 180 с. [Ashmarin IP, Vorob’ev AA. Statisticheskie metody v mikrobiologicheskikh issledovaniyakh. Leningrad: Meditsinskaya literatura; 1962. 180 p. (In Russ).]