Background. The cultured cheek mucosa epithelium (buccal epithelium, BE) is used for autologous transplants generation and tissue engineering. An alternative source of cells for these purposes may be the lip mucosa, covered, like BE, with non-keratinized stratified squamous epithelium, but with some histological distinctions. Aims — to characterize the human lip mucosa as a promising source of epithelial cells for autologous transplantation and tissue engineering. Methods. Scrapings of the lip, cheek, and gum mucosa from five healthy volunteers were analyzed by cytofluorimetry to determine the level of desquamation and cytokeratin (CK) 10 and 13 expression. The lip mucosa of two patients was characterized using routine histological staining and fluorescence immunohistochemistry for CK 3, 4, 10, 13, and p63 marker. 35 samples of full-thickness strips of the patient’s lip mucosa were used to set the explant (n = 18) and enzymatic (n = 17) techniques for expansion epithelium. Culture systems with 1.05 and 0.06 mM Calcium contained 5% fetal bovine serum, 5 μg/ml human insulin, 5 μg/ml hydrocortisone, 10 ng/ml human epidermal growth factor. Stable cultures were stained for p63, vimentin, zonula occludens-1 (ZO-1), and CK10. Software tools determined levels of their expression. Results. The number of cells in the lip and gum samples was significantly lower than from the cheek. The median number of CK13 positive cells was significantly different for the gum (6.4%) and cheek (64.8%, p = 0.0089). Significant differences for CK10 positive cells were not observed. The epithelium of the lip mucosa was 72.1 ± 3.6 μm thick, relatively flat, and without keratinization sites. Samples were positively stained for CK 4 and 13, in the absence of expression of CK 3 and 10. The primary culture of epithelial cells obtained by explant technique was significantly more effective (p = 0.001) in comparison with the enzymatic method. Stable cultures had a “cobble-stone” morphology in both culture systems. The levels of vimentin and p63 expression in both culture systems was not significantly differ. ZO-1 expression was 3.6-fold higher for 1.05-mM Ca++ medium (p = 0.0006). Conclusions. Epithelium cell culture from the lip mucosa can be obtained by culturing explants without a feeder layer. Quality control steps have been developed for cultured cells and biopsy site.
Обоснование. Культивированный эпителий слизистой щеки (буккальный эпителий, БЭ) используется для создания аутологичных трансплантатов и тканевой инженерии. Альтернативным источником клеток для этих целей может являться слизистая губы, покрытая, как и БЭ, неороговевающим многослойным плоским эпителием, но имеющая некоторые гистологические отличия. Цель исследования — охарактеризовать эпителий слизистой губы человека как перспективный источник эпителиальных клеток для аутологичной трансплантации и тканевой инженерии. Методы. Цитофлуориметрия соскобов слизистой губы, щеки и десны была выполнена по оригинальному протоколу у 5 здоровых добровольцев для определения уровня десквамации поверхностных клеток и экспрессии цитокератинов (CK) 10 и 13. Слизистая губы от двух пациентов была охарактеризована с помощью рутинной гистологической окраски и флуоресцентной иммуногистохимии на CK 3, 4, 10, 13 и пролиферативный маркер p63. 35 образцов полнослойного лоскута слизистой губы от пациентов были использованы для постановки эксплантной (n = 18) и ферментативной (n = 17) техник выделения первичной культуры эпителия. Культуральные системы с 1,05 и 0,06 мМ кальция содержали 5% фетальной бычьей сыворотки, 5 мкг/мл инсулина растворимого человеческого, 5 мкг/мл гидрокортизона и 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста. Стабильные культуры эпителия были окрашены на маркер p63, виментин, белок плотных межклеточных контактов (ZO-1) и CK 10, уровни экспрессии которых были определены программными средствами. Результаты. По данным цитофлуориметрии число клеток в соскобах с губы и десны было достоверно ниже, чем со щеки. Число CK13-позитивных клеток по медиане достоверно отличалось для соскобов с десны (6,4%) и со щеки (64,8%, р = 0,0089). Достоверных отличий по CK10-позитивным клеткам в соскобах не отмечали. Эпителий слизистой губы толщиной 72,1 ± 3,6 мкм был представлен неороговевающим многослойным плоским, без участков кератинизации и положительно окрашивался на маркеры СК 4 и 13 в отсутствие экспрессии СК 3 и 10. Первичная культура клеток эпителия, полученная путем культивирования эксплантов, была достоверно более результативна (p = 0,001) в сравнении с ферментативным способом. Стабильные культуры имели характерную морфологию в обеих культуральных системах. Уровень экспрессии виментина и ядерного транскрипционного фактора р63 в культуральных системах достоверно не отличался. Маркер ZO-1 был в 3,6 раза более выражен при культивировании в среде с 1,05 мМ Ca++ (p = 0,0006). Заключение. Культура клеток эпителия слизистой губы может быть получена путем культивирования эксплантов без фидерного слоя. Разработаны этапы контроля качества для культивированных клеток и участка биопсии.