Bacterial vaginosis: the role of microbiota and prospects

Full Text

Введение

Бактериальный вагиноз (БВ) — это дисбиоз вагинальной микробиоты, характеризующийся переходом от доминирования лактобацилл к превалированию смеси облигатных и факультативных анаэробных условно-патогенных микроорганизмов. Данное состояние считается одним из наиболее значимых урогенитальных заболеваний и занимает лидирующее место в структуре причин аномальных выделений из влагалища у женщин репродуктивного возраста. Встречаемость данной патологии высока во всем мире и варьируется в зависимости от региона и контингента обследуемых женщин. Выявлена взаимосвязь между распространенностью БВ и этническими группами: так, встречаемость БВ наиболее высока среди женщин в странах Африки (около 60%), умеренная распространенность наблюдается в Южной и Юго-Восточной Азии, Латинской Америке и США (23–29%), а самый низкий уровень отмечается в Австралии, Новой Зеландии и Западной Европе (около 8%) [1]. Примерно в 50% случаев БВ протекает бессимптомно, в связи с чем истинная распространенность гораздо выше заявленной. Помимо высокой распространенности, большую проблему представляет частота рецидивов БВ после курса лечения, которая оценивается в 50–80% при наблюдении в течение 6 мес [2]. Приведенные статистические цифры свидетельствуют об актуальности данной проблемы в сфере здравоохранения.

Факторы, предрасполагающие к развитию у женщины бактериального вагиноза, условно можно разделить на эндо- и экзогенные. К эндогенным относятся гормональные изменения (возрастные — в пубертатном периоде и менопаузе, при патологии беременности, в послеродовом и послеабортном периодах), гипотрофия и атрофия слизистой оболочки влагалища, наличие кист и полипов стенок влагалища и др.; к экзогенным — инфицирование возбудителями инфекций, передающихся половым путем (ИППП), и колонизация половых путей генитальными микоплазмами, лекарственная терапия (антибактериальными препаратами системного действия, цитостатическими противоопухолевыми препаратами, глюкокортикостероидами), лучевая терапия, присутствие инородных тел во влагалище и матке, пороки развития половых органов или их деформации после родов и хирургических вмешательств, нарушение гигиены половых органов, в том числе частое применение спринцеваний и вагинальных душей, использование интравагинальных контрацептивов, в том числе спермицидов.

Важно отметить, что БВ не считается ИППП, поскольку он вызывается чрезмерным размножением эндогенных вагинальных бактерий, что не соответствует определению ИППП. Кроме того, ранее было принято считать, что развитие БВ напрямую связано с большим количеством половых партнеров, однако Gardnerella vaginalis может быть обнаружена во влагалище женщин, не имевших сексуального опыта [3]. Тем не менее во многих исследованиях обнаруживается сочетанное выявление БВ у женщин, обратившихся к врачу по поводу ИППП. Предполагается, что вследствие дефицита лактобацилл и роста показателя рН в щелочную сторону снижается общая резистентность нормальной микробиоты, что обеспечивает повышенную восприимчивость к патогенным агентам. Так, женщины с БВ подвержены повышенному риску заражения ВИЧ, хламидиозом, гонореей, трихомониазом, Mycoplasma genitalium, ВПЧ, вирусом простого герпеса 2-го типа [4–6].

Учитывая частую бессимптомность течения БВ и, как следствие, недостаточную диагностику и отсутствие лечения, у женщины могут развиваться сопутствующие патологии репродуктивной системы: неоплазии шейки матки, инфекции мочевыводящих путей, хронические тазовые боли и воспалительные заболевания органов малого таза, бесплодие [7]. БВ также является фактором риска развития осложнений беременности: самопроизвольных абортов, внутриамниотической инфекции, преждевременного излития околоплодных вод, преждевременных родов, рождения детей с низкой массой тела [8, 9].

В настоящее время представления об этиологии БВ и оптимальные стратегии ведения продолжают расширяться и дополняться. Определенно понимание современных микроэкологических аспектов репродуктивного тракта и представление об отдельных микроорганизмах и их взаимодействии имеют решающее значение для подбора эффективной стратегии ведения пациенток с бактериальным вагинозом.

Цель данной статьи — изучение БВ, охватывающее современные представления о микробном биосоциуме, который опосредует развитие заболевания, и перспективных методах лечения. Статья призвана расширить знания, необходимые для эффективного распознавания и ведения БВ в клинической практике, что потенциально будет улучшать результаты диагностики и лечения пациентов и качество оказываемой медицинской помощи, особенно в условиях повышения частоты рецидивов.

Современные микроэкологические аспекты репродуктивного тракта

Вагинальная микробиота — это сложная и динамическая экосистема, подверженная постоянным колебаниям на протяжении всей жизни женщины. Изменчивость микробиологических сообществ определяется действием как экзогенных, так и эндогенных факторов. Так, на биоценоз оказывают влияние физиологические и гормональные изменения (пубертатный период, беременность, менопауза), фазы менструального цикла, различные нарушения менструальной функции. Также большое значение имеют степень половой активности, использование антибактериальных препаратов, гормонотерапия, хирургические вмешательства [10].

Уже довольно продолжительное время известно, что нормальный микроэкологический фон влагалища обусловлен микрорганизмами рода Lactobacillus в составе вагинальной микробиоты. Считается, что в норме данные микроорганизмы должны выделяться из влагалища в количестве выше 10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл исследуемого образца, составляя от 70 до 90% всего влагалищного микробиологического сообщества [11]. Лактобациллы способствуют поддержанию экосистемы влагалища в состоянии равновесия в основном за счет выработки антимикробных соединений, из которых наибольшее значение имеют перекись водорода, различные бактериоциноподобные вещества и молочная кислота, которая, в свою очередь, опосредует кислую среду влагалища (pH 3,5–4,5). Низкие значения pH, с одной стороны, еще больше способствуют росту и численному превалированию лактобацилл, а с другой — предотвращают колонизацию локуса патогенными микроорганизмами.

Таким образом, род Lactobacillus оказывает значительное влияние на успешность репродуктивной функции. При этом эубиоз как влагалища, так и репродуктивного тракта в целом способствует не только резистентности к инфекциям, но и благоприятной реализации процесса оплодотворения и последующей восприимчивости эндометрия к имплантации эмбриона. Такой функциональный эффект микробиоты опосредуется различными метаболитами лактобацилл, например глицерофосфолипидами и бензопираном, которые влияют на выработку простагландинов, регулирующих ангиогенез в репродуктивном тракте и перемещение бластоцисты путем влияния на тонус миометрия [12].

Кроме того, многие виды Lactobacillus во влагалище создают своеобразный экологический барьер, занимая рецепторы клеток слизистых оболочек урогенитального тракта и тем самым обусловливая феномен так называемой колонизационной резистентности. Также данные микроорганизмы способны сдерживать рост патогенной флоры путем регуляции иммунного ответа хозяина [13].

На основе преобладающих видов лактобацилл было определено пять наиболее часто встречающихся типов состояния микробиологических сообществ влагалища. В первом типе преобладает микроорганизм Lactobacillus crispatus, во втором — Lactobacillus gasseri, в третьем — Lactobacillus iners, в пятом превалирует Lactobacillus jensenii, а четвертый отличается преобладанием облигатно- и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Каждый тип определяет различный рН влагалища и другие микроэкологические особенности у отдельных групп пациенток. При этом существуют определенные закономерности в структуре типов сообществ у различных этнических групп: например, у женщин европеоидной расы в большинстве случаев в составе влагалищной микробиоты доминирует L. crispatus, а у африканок и латиноамериканок — L. iners [14]. В настоящее время в практику внедрен тест «Типирование лактобактерий» для определения общего количества лактобацилл в дополнение к идентификации наиболее распространенных видов Lactobacillus во влагалище — L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis и L. acidophilus [15].

Отдельно стоит отметить такого представителя нормальной микробиоты, как L. iners. Данный микроорганизм играет более противоречивую роль по сравнению с другими лактобациллами. В частности, эта бактерия менее кислотоустойчива, не продуцирует пероксид водорода, в норме выполняющий бактерицидную функцию, а также не культивируется на стандартном агаре для Lactobacillus spp, ввиду чего очень долгое время она была вне поля зрения исследователей. Микробные сообщества, в которых преобладает L. iners, обеспечивают менее надежную защиту от патогенной флоры в силу физиологических особенностей этого микроорганизма. Более того, некоторые ученые считают, что данная бактерия может проявлять и патогенные свойства, становясь одним из этиологических агентов при БВ [16]. Это также связано с ее метаболическими особенностями: при разложении гликогена этой бактерией образуется в основном левовращающий изомер молочной кислоты, имеющий воспалительный потенциал. Данный факт, в свою очередь, обусловлен отсутствием у L. iners фермента D-лактатдегидрогеназы. Некоторые ассоциируют доминирование L. iners с развитием бесплодия [17]. Все перечисленное особенно примечательно, учитывая описанное выше преобладание этого микроорганизма у африканских женщин, у которых БВ встречается статистически чаще.

В настоящее время исследователями не прекращаются попытки обновить общее понимание основ функционирования микробиоты влагалища в норме и при развитии БВ [18]. Так, усилия научного сообщества в данном направлении способствовали уходу из клинической практики такого понятия, как гарднереллезный вагинит. Связано это непосредственно с появлением доказательств того, что бактерии рода Gardnerella не являются единственными этиологическими агентами при развитии БВ [19]. Современный термин «бактериальный вагиноз» устоялся в литературе параллельно с более глубоким пониманием патогенеза данного состояния (чрезмерный рост различного рода анаэробных бактерий в экосистеме влагалища и следующий за этим микроэкологический дисбаланс). На текущем этапе изучения данной проблемы ведущую роль при БВ играют именно анаэробные микроорганизмы, естественно присутствующие во влагалище. При этом могут наблюдаться как отдельные качественные изменения видового состава микробиоты влагалища, так и увеличение общей численности вагинальных микроорганизмов [20].

Тем не менее концепция влагалищного дисбиоза по‐прежнему порождает споры относительно ее определения и практического применения. Некоторые авторы используют термин «дисбиоз» при состояниях, когда лактобациллы перестают доминировать в микробиоте влагалища и это проявляется в виде определенных клинических симптомов. В целом с микробиологической точки зрения БВ сопровождается уменьшением численности видов лактобацилл и избыточным ростом таких бактерий, как Gardnerella spp., Fannyhessea vaginae, Prevotella bivia, Mobiluncus spp., Peptostreptococcus anaerobius, Megasphaera spp. и т.д. Данные микроорганизмы способны проявлять синергические взаимодействия во время инфекции и образовывать полимикробные биопленки на эпителии влагалища, которые в настоящее время вызывают повышенный исследовательский интерес.

В аспекте БВ довольно спорным является вопрос значения четвертого типа микробиологического сообщества влагалища, при котором доминирует преимущественно эндогенная облигатно- и факультативно-анаэробная флора. При этом некоторые авторы в данном типе также выделяют два подтипа: к первому относят такие микроорганизмы, как Anaerococus spp., Peptoniphilus spp., Corynebacterium spp., Prevotella spp., Finegoldia spp. и Streptococcus spp, ко второму — Fannyhessea spp., Gardnerella spp., Sneathia spp., Mobiluncus spp., Megasphera spp. В связи с тем, что данные паттерны встречаются относительно часто, на данный момент отсутствует устоявшееся мнение, является ли четвертый тип сообщества вариантом нормы или признаком бессимптомного течения БВ [21]. Все это диктует необходимость более глубокого изучения вовлеченности отдельных микроорганизмов и микробиологических сообществ в патологические процессы при БВ.

Далее в статье рассмотрены современные представления о микроорганизмах, вовлеченных в развитие БВ, с точки зрения как их индивидуальных особенностей и факторов патогенности, так и способности вступать в ассоциации друг с другом, в том числе посредством образования биопленок.

Биопленки

Согласно современным определениям, биопленки представляют собой сообщества микроорганизмов, которые прикреплены друг к другу или к поверхности и погружены в матрикс из синтезированных ими полимерных молекул. Данная форма взаимодействия бактерий обеспечивает повышенную устойчивость к факторам внешней среды и значительное увеличение выживаемости при наличии агрессивных сред и антимикробных препаратов. С проблемой бактериальных биопленок сталкиваются специалисты различных сфер медицины. Так, согласно данным CDC (Centers for Disease Control and Prevention, США), около 65% всех инфекционных заболеваний сопровождается развитием биопленок. Особенно остро этот вопрос стоит при БВ: у пациенток с БВ биопленки выявляются в 90% наблюдений [22], что обеспечивает хронизацию патологического процесса в микробиоте влагалища, устойчивость к традиционным схемам лечения, частые клинические рецидивы и, как следствие, развитие осложнений в дальнейшем. Кроме того, биопленки при БВ могут распространяться восходящим путем за пределы влагалища: с помощью метода FISH характерные биопленки были обнаружены в образцах эндометрия, фаллопиевых труб и материала после самопроизвольного аборта у пациенток с БВ [23].

Точный механизм развития биопленок при БВ не определен, но предполагается, что он соответствует общим представлениям о стадиях формирования биопленок других локализаций. Вначале происходит адгезия бактерий к субстрату: в случае с БВ — к эпителию влагалища с предшествующим вытеснением лактобацилл. Затем следует созревание и укрепление биопленки, во время которого микроорганизмы теряют подвижность, их прикрепление становится необратимым, и слой биопленки утолщается с образованием кластеров микроколоний различных анаэробных видов и выделением ими полимерных «склеивающих» веществ (липополисахаридов, гликопротеидов, протеогликанов, нуклеиновых кислот, гуминовых веществ, внеклеточной ДНК). Конечный этап — процесс дисперсии (распада), во время которого агрегаты бактерий, прилипшие к эпителиальным клеткам влагалища (получившие название «клетки-ключи») [24], способны активно покидать биопленку и распределяться за ее пределы [25]. Таким образом, биопленка формируется в ходе динамичного и сложного процесса молекулярного межклеточного взаимодействия нескольких видов бактерий, а также клеток эпителия влагалища.

В составе биопленок при БВ было обнаружено множество микроорганизмов: Prevotella spp., Porphyromonas spp., Bacteroides spp., Peptostreptococcus spp., Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Mobiluncus spp., Fannyhessea vaginae, Porphyromonas assaccharolytica, Megasphera spp., Sneathia sanguinegens, Candidatus Lachnocurva vaginae, Mageeibacillus indolicus, Leptotrichia amnionii и Eggerthella spp. [26], однако ключевая роль в процессе запуска формирования биопленки принадлежит G. vaginalis. В исследованиях in vitro G. vaginalis была единственным видом, который смог увеличить свою концентрацию как в моно-, так и поликультурных биопленках, сформированных в питательной среде или в среде, имитирующей выделения из влагалища [27]. Кроме того, было доказано влияние G. vaginalis на жизнеспособность других микроорганизмов в биопленке: почти 92% клеток F. vaginae погибало после 48 часов роста в монокультуре, но сохраняли жизнеспособность при совместном культивировании с G. vaginalis или после предварительного кондиционирования бесклеточным супернатантом культур данного микроорганизма [28]. Кроме того, у женщин с G. vaginalis и F. vaginae чаще рецидивирует БВ, чем у женщин только с G. vaginalis, что также демонстрирует тесную межвидовую взаимосвязь в составе биопленки. Признана также синергическая связь между P. bivia и G. vaginalis, при которой P. bivia вырабатывает аммиак, используемый G. vaginalis, которая, в свою очередь, вырабатывает аминокислоты, используемые P. bivia, что тоже может объяснить некоторые проявления БВ [29]. В одном из проспективных исследований с помощью секвенирования гена 16S рибосомальной РНК был доказан значительный рост относительного количества P. bivia, G. vaginalis, F. vaginae и Megasphaera spp. типа 1 за 4 дня до развития клинических проявлений БВ, что может свидетельствовать о совместной роли данных микроорганизмов в инициации проявлений заболевания [30].

Отдельное внимание обращают на себя ключевые клетки, являющиеся диагностическим критерием БВ при микроскопии. С помощью метода одноэтапной многоцветной гибридизации с зондом Bif164-C3 в сочетании с зондом LGC-C5 удалось оценить пространственные взаимоотношения микроорганизмов в биопленке, сцепленность их между собой и степень адгезии отдельных групп к эпителию влагалища [31]. Оценивались семейство Bifidobacteriaceae, Gardnerella spp., F. vaginae, L. iner, L. crispatus, Enterobacteriaceae, Prevotella spp., Bacteroides spp., Veillonella spp. и Coriobacterium spp. В ходе исследования было выделено четыре паттерна взаимодействия: дисперсные неадгезивные бактерии, дисперсные адгезивные бактерии, сцепленные неадгезивные бактерии и сцепленные адгезивные бактерии. Согласно определению, ключевые клетки представляют собой эпителиоциты, густо покрытые адгезивными бактериями. При оценке методом FISH прямая адгезия к эпителиальным клеткам была характерна только для видов Gardnerella spp. и наблюдалась только в 56% исследованных образцов (доля женщин с истинными ключевыми клетками в образцах из разных гинекологических клиник варьировалась от 19 до 80%). В остальных образцах эпителиоциты были механически заключены в бактериальные массы, а бактерии, в свою очередь, не были связаны с поверхностью эпителиальных клеток (неадгезивные псевдоключевые клетки). Таким образом, ключевая роль в адгезии и запуске процесса образования биопленки, а также присоединения других анаэробных видов все же остается за G. vaginalis.

Несмотря на видовое разнообразие бактерий, ассоциированных с БВ, ни одна из них не обладает достаточной чувствительностью или специфичностью для диагностических целей. Однако в совокупности с наличием G. vaginalis (≥ 10⁹ копий/мл) и F. vaginae (≥ 10⁸ копий/ мл) в сочетании со снижением ДНК Lactobacillus и определение БВ-ассоциантов могут свидетельствовать о наличии у женщины БВ. Что касается диагностики полимикробных биопленок, единственным методом прямого их обнаружения является флуоресцентная гибридизация in situ (метод FISH): благодаря фоновой флуоресценции он одновременно позволяет проводить таксономическую идентификацию и оценивать пространственное расположение микроорганизмов, а также определять морфологию анализируемого материала [32]. Именно методом FISH впервые были обнаружены полимикробные биопленки, преимущественно состоящие из Gardnerella spp. и F. vaginaе у женщин с БВ. Кроме того, косвенное обнаружение биопленки возможно с помощью количественной мультиплексной ПЦР [33]. Несмотря на отсутствие стандартизированных подходов к изучению, актуальность проблемы биопленок не угасает и подчеркивается развитием новых методов их исследования.

Клиническое значение отдельных микроорганизмов при бактериальном вагинозе

Переходя к индивидуальным особенностям БВ-ассоциированных микроорганизмов и учитывая «пусковое» значение в инициации формирования биопленок G. vaginalis, стоит начать именно с нее. Это грамвариабельный палочковидный анаэробный микроорганизм, имеющий в арсенале такие факторы патогенности, как цитотоксин, муколитические ферменты (сиалидазы), фосфолипаза А [19]. Очень часто многие исследователи связывают преобладание данной бактерии с различными неблагоприятными репродуктивными исходами — выкидышами, преждевременными родами, низкой массой тела и нарушением нервно-психического развития новорожденных [34].

Экзотоксин G. vaginalis, носящий название «вагинолизин», представляет собой порообразующий токсин, тропный к эпителию слизистой оболочки влагалища и эритроцитам человека. Этот фактор патогенности активирует в клетках определенные процессы, ведущие к повышенной продукции интерлейкина-8 (IL-8) и развитию иммунопатологических процессов в локусе. Cиалидазы микроорганизма прежде всего способствуют его успешной адгезии к эпителию, а также разрушению такого защитного фактора, как секреторный IgA [35]. Стоит сказать, что для микроорганизмов, способных к продукции липаз, характерен особенно высокий патогенный потенциал. Это связано в первую очередь с влиянием данных ферментов на синтез простагландинов, что обусловливает не только более интенсивные воспалительные процессы, но и возможность преждевременного прерывания родов, что связано с физиологическим действием простагландинов.

G. vaginalis при повышенном представительстве во влагалищном локусе становится причиной, с одной стороны, недостаточного иммунного ответа со сниженным привлечением Т-лимфоцитов, а с другой — атипичных воспалительных реакций с избыточной секрецией фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерферона гамма (IFN-γ). В испытаниях на мышах было определено, что наличие этого микроорганизма связано со сниженной частотой выделения из тканей влагалища одного из белков десмосом — структур, обеспечивающих клеточные контакты. Это может приводить к нарушению барьерной функции слизистой оболочки влагалища и повышенной уязвимости к ИППП, например герпетической инфекции. Данные взаимосвязи, вероятно, обусловливают повышенную частоту ИППП у пациенток с БВ [36].

В одной из статей, посвященных клиническому значению G. vaginalis, также описывается возможный механизм влияния данного патогена на возникновение бесплодия. S. Dohadwala et al. связывают ферменты из группы сиалидаз, продуцируемые микроорганизмом, с негативным воздействием на гликокаликс сперматозоидов. При изменении структуры гликопротеиновых компонентов мембраны мужских половых клеток происходит их лизис белком комплемента и агглютинация [37].

Также G. vaginalis примечательна частым образованием ассоциаций с другими факультативно-анаэробными и анаэробными микроорганизмами, и очень часто данные взаимосвязи обусловлены способностью G. vaginalis образовывать биопленки, о чем было сказано в предыдущем разделе.

На данный момент многие авторы до сих пор считают, что описанный микроорганизм играет наиболее значимую роль в развитии БВ, в то время как все остальные микроорганизмы, встречающиеся при этом заболевании, вносят дополнительный вклад в микроэкологический дисбаланс [19].

Также стоит отметить, что, хотя согласно классическим данным род Gardnerella долгое время состоял из одного вышеописанного вида, на данный момент в литературе можно найти информацию о значительной генотипической и биотипической неоднородности Gardnerella spp. и наличии таких видов, как Gardnerella swidsinskii, Gardnerella leopoldii и Gardnerella piotii, каждый из которых так или иначе связан с наличием БВ у пациенток и отдельными диагностическими критериями БВ [38, 39]. Считается, что G. swidsinskii обладает особенностями строения полисахаридной капсулы, что обусловливает его своеобразное воздействие на toll-like-рецепторы и стимуляцию воспалительных процессов. Кроме того, для каждого вида характерна некоторая специфика клинической картины БВ. Например, при повышенной численности в составе микробиоты G. leopoldii и G. piotii не была выявлена связь между этими видами и наличием таких симптомов, как выделения и неприятный запах из влагалища, что теоретически позволяет ассоциировать данные микроорганизмы с бессимптомными формами БВ. В то же время, согласно другим подобным исследованиям, G. leopoldii, а также G. swidsinskii чаще встречаются у пациенток с рецидивирующими вариантами БВ.

Род Prevotella — облигатно-анаэробные грамотрицательные неспорообразующие палочки, входящие в состав нормальной микробиоты таких локусов, как полость рта, дистальные отделы желудочно-кишечного тракта и женский урогенитальный тракт. В аспекте БВ наибольший интерес представляют виды P. bivia и P. timonensis.

Частота встречаемости Prevotella spp. в микробиоте репродуктивного тракта у здоровых женщин по разным данным достигает 60%, тогда как у пациенток с бактериальным вагинозом ДНК данного таксона может выделяться в 70–80% случаев. При этом, как и для большинства остальных вагиноз-ассоциированных бактерий, для микроорганизмов этого рода характерна высокая частота ассоциаций с G. vaginalis (особенно для P. bivia) [40].

К факторам патогенности данных видов можно отнести поверхностные белки адгезии, тропные в том числе к вагинальному эпителию, факторы инвазии, обусловливающие способность бактерий к внутриклеточному паразитированию (что позволяет им получать дополнительные питательные вещества и ускользать от иммунного ответа), различные гидролитические ферменты (сериновые протеазы, цистеиновые протеазы, IgA-протеазы), в том числе внеклеточные, также позволяющие получать как питательный субстрат, так и дополнительную защиту от иммунитета хозяина [41]. Симбиоз Prevotella spp. с G. vaginalis связан с повышенной выработкой аммиака и синтезом сиалидаз, а также увеличением pH [42, 43].

Огромное значение для клинической значимости Prevotella spp. играют сиалидазы и фукозидазы, продуцируемые данными бактериями, действие которых может опосредовать адгезивность других БВ-ассоциированных бактерий. В нескольких статьях отмечается высокое разнообразие данных ферментов, кодируемых различными генами представителей рода Prevotella. Некоторые авторы считают, что эти микроорганизмы являются более значимыми продуцентами сиалидаз, чем G. vaginalis. При этом P. bivia достоверно связана с повышенной частотой рецидивов БВ, а P. timonensis — c преждевременными родами [44].

Другие авторы отмечают, что сиалидазы и фукозидазы P. timonensis способны разлагать гликопротеины влагалища даже при выраженной кислой среде (в то время как большинство ферментов данной группы действует при значениях pH выше 4,5, являясь непосредственно ассоциированными с БВ). Предполагается, что подобная активность сиалидаз, которая имеет место даже в микробиологических сообществах с доминированием Lactobacilus spp., может играть инициирующую роль при типичных для БВ изменениях микроэкологии [42].

Fannyhessea vaginae (ранее известный как Atopobium vaginae) — облигатно-анаэробная грамположительная коккобацилла. В 8–25% случаев она является компонентом нормальной микробиоты урогенитального тракта, но при различных нарушениях может быть частью микробных ассоциаций, формирующихся при БВ (90–100%), или вызывать БВ самостоятельно (1–40%) [45].

При преобладании F. vaginae в составе влагалищной микробиоты клиническая картина БВ не имеет специ-фических особенностей. Отличительной чертой данного микроорганизма являются более низкие цитотоксические и адгезивные свойства в сравнении с Gardnerella spp. С другой стороны, некоторые ферменты бактерии обладают ингибирующим действием на систему комплемента [41]. Была продемонстрирована положительная связь F. vaginae с частотой самопроизвольных абортов и преждевременных родов в ассоциации с G. vaginalis. Также считается, что данный патоген способен запускать ряд иммунопатологических механизмов, стимулируя избыточную продукцию различных провоспалительных молекул (IL-6, IL-8, β-дефензин). Кроме того, большинство штаммов устойчивы к препаратам группы нитроимидазолов, что указывает на необходимость использования альтернативных метронидазолу схем лечения при выделении F. vaginae. Высокая устойчивость микроорганизма к антимикробным препаратам также объясняет его частую вовлеченность в рецидивирующие варианты БВ. Также согласно ряду исследований F. vaginae является одним из самых специфичных диагностических маркеров БВ, превосходя даже G. vaginalis [46].

Другими клинически важными в аспекте БВ микроорганизмами являются бактерии рода Mobiluncus. Представители данного таксона — это грамвариабельные подвижные палочки изогнутой формы. Наиболее значимыми возбудителями рода являются Mobiluncus curtisi и Mobiluncus mulieris [47]. Считается, что Mobiluncus spp. обладает прямой связью с высокими баллами по методу Nugent (см. раздел диагностики) и частотой преждевременных родов у пациенток с БВ. Согласно данным научной литературы, M. curtisi и M. mulieris способны опосредовать повышенную выработку IL-6, IL-8 и TNF-α иммунными клетками, воздействуя на toll-like-рецепторы 5-го типа (TLR-5) [48]. Также была продемонстрирована связь M. mulieris с возникновением окислительного стресса при БВ, который ведет к снижению барьерной функции эпителиоцитов влагалища. Вероятно, этот процесс связан с влиянием микроорганизма на снижение синтеза таких веществ, как цистеинилглицин и дисульфид цистеинилглицина, в свою очередь являющихся звеньями в синтезе глутатиона. Еще один вклад Mobiluncus spp. в развитие патологических процессов при БВ связан с продукцией органических кислот (например, сукцината), подавляющих функции лейкоцитов.

Megasphera типа 1 и 2 представляют собой группу грамотрицательных облигатно-анаэробных комменсалов влагалищной микробиоты, связанных с бактериальным вагинозом и ухудшением репродуктивного здоровья. Типы 1 и 2 были определены на основании геномной структуры, метаболического потенциала и клинических ассоциаций. Множество исследований указывают на преобладание данного рода микроорганизмов у пациенток с БВ в сравнении со здоровыми женщинами [44]. В литературе представлены отдельные виды, ассоциированные с вагинозом: Megasphera vaginalis, Megasphera lornae, Megasphera hutchinsoni, Megasphera elsdenii. В большинстве случаев штаммы чувствительны к метронидазолу и клиндамицину и не представляют серьезных трудностей в терапии [49].

В научной литературе немного сведений о патогенетическом значении Megasphera spp., хотя некоторые авторы пишут о наличии у M. microuniformis определенных цитотоксических свойств в отношении эпителия шейки матки и способности M. elsdenii индуцировать выработку основных провоспалительных агентов [50]. Воспалительный потенциал Megasphera spp. может быть обусловлен влиянием на повышение продукции короткоцепочечных жирных кислот и их производных, например N-пальмитоил-сфингозина.

Примечательно, что собратья Megasphera spp. по семейству Veillonellaceae, род Veillonella (например, Veillonella atypica и Veillonella montpellierensis), способны, с одной стороны, потреблять лактат влагалища в качестве источника питания, а с другой — образовывать значительное количество аминов, некоторые из аминов помимо увеличения pH в локусе имеют и другое патогенетическое значение (к примеру, гистамин способен снижать экспрессию белков межклеточных контактов). Учитывая вышеизложенное, можно утверждать, что Veillonella spp. играют наиболее значимую роль на изначальном этапе БВ, когда во влагалище еще сохраняются низкие значения pH и высокое содержание лактата, в то время как Megasphera spp. являются так называемыми вторичными колонизаторами, реализующими свой провоспалительный потенциал в среде с уже измененной микроэкологией [24].

Согласно результатам отдельных исследований, довольно широкой распространенностью при БВ обладают Eggerthella spp. (вплоть до 85–95%). Данные микроорганизмы — грамположительные неподвижные облигатно-анаэробные коккобациллы, которые достоверно связывают со всеми критериями БВ по Amsel [51]. Это обусловлено в первую очередь их способностью к продукции биогенных аминов, в особенности путрецсина и кадаверина. Кроме того, Eggerthella spp. ассоциированы с повышенным уровнем глицеролипидов и сфинголипидов, клиническое значение которых было описано выше.

Sneathia spp. — грамотрицательные неподвижные палочки, клиническое значение которых в акушерско-гинекологической практике продолжает возрастать в связи со способностью данных микроорганизмов вызывать инфекционные процессы в верхнем репродуктивном тракте, плаценте и плодных оболочках [52]. Род включает такие виды, как Sneathia amnii и Sneathia sanguinegens. Считается, что данные микроорганизмы также относительно часто входят в состав влагалищной микробиоты при БВ и могут быть связаны с образованием биопленок. Кроме того, в ряде статей описано, что представители Sneathia spp. (как минимум, S. amnii) обладают определенными факторами патогенности, например порообразующим экзотоксином CptA (действует на эпителиоциты влагалища и шейки матки, клетки амниона и хориона) и O-сиалогликопротеин-эндопептидазой (способствует перемещению возбудителей в верхние отделы урогенитального пути через цервикальную слизь) [53]. Действие этих агентов обусловливает вышеописанную возможность вызывать инфекции как материнского организма, так и плода (например, хориоамнионит), что связано с индукцией воспаления через стимуляцию выработки IL-1α, IL-1β и IL-8 [52]. Такой пример демонстрирует один из возможных механизмов инфекционно-воспалительных осложнений БВ. Микроорганизмы, которые преобладают в составе микробиоты влагалища, вследствие дисбиотических изменений могут транслоцировать в локусы верхнего репродуктивного тракта, где и будут реализовывать свой патогенный потенциал.

Bacteroides spp. — облигатно-анаэробные грамотрицательные бактерии, которые в норме выделяются из влагалища у 10–15% здоровых женщин. К роду относятся Bacteroides utealyticum и Bacteroides fragilis group (В. fragilis, B. vulgatus, B. ovatus, B. distasonis, B. uniformis, B. caccae, B. multiacidus). В норме их количество в урогенитальным тракте не превышает 10⁴ КОЕ/мл образца.

В патогенезе Bacteroides-ассоциированного вагиноза ключевым звеном выступают такие факторы патогенности данных микроорганизмов, как гиалуронидаза, коллагеназа, фибринолизин, IgA-протеазы, гепариназа и сиалидаза. Способность продуцировать каталазы является главным фактором защиты от H₂O₂ лактобацилл. Также у бактероидов есть способность к продукции фосфолипаз, что также, как и для других уже описанных возбудителей, связывают с неблагоприятными исходами беременности. Bacteroides spp. подобно роду Mobiluncus способны продуцировать янтарную кислоту, ингибирующую активность нейтрофильных лейкоцитов и тем самым снижающую иммунный ответ [42].

Как в желудочно-кишечном, так и в урогенитальном тракте представители рода являются основными носителями генов резистентности среди облигатно-анаэробных бактерий, в том числе к метронидазолу и β-лактамам. Несмотря на это, многие исследования говорят о низкой экспрессии генов устойчивости у самих B. fragilis, что клинически проявляется высокой чувствительностью к большинству препаратов [54].

Диагностика

В соответствии с европейскими руководствами, для диагностики БВ могут применяться следующие подходы: клинические критерии (критерии Amsel), микроскопический метод с оценкой баллов Nugent, микроскопический метод в соответствии со шкалой Ison/Hay и молекулярно-биологические методы для определения ДНК БВ-ассоциированных микроорганизмов.

Для подтверждения диагноза необходимо наличие трех из четырех следующих критериев Amsel (1983 г.):

1. гомогенные или жидкие серо-белые выделения из влагалища (характерный признак и основная жалоба пациенток с БВ при симптомном течении);
2. рН вагинальных выделений > 4,5 (вследствие снижения содержания Lactobacillus spp. и выработки ими молочной кислоты);
3. «рыбный» запах выделений при добавлении 10% КОН (из-за выделения анаэробными бактериями аминов);
4. наличие «ключевых» клеток при микроскопии нативного препарата — более 20% (клетки влагалищного эпителия, сплошь или частично покрытые грамвариабельной, но чаще грамотрицательной флорой).

Преимущества: удобный метод в амбулаторных условиях; не требует высоких навыков микроскопирования; экономия времени. Недостатки: низкая чувствительность и специфичность; не учитывается влияние гипоэстрогении на pH влагалища и состав вагинальной микробиоты в период менопаузы [55].

Микроскопический метод с оценкой баллов Nugent (1991) является «золотым стандартом» в диагностике БВ. Баллы Nugent основаны на результатах микроскопии мазка, окрашенного по Граму, с подсчетом и оценкой соотношения различных морфотипов: Lactobacillus spp. (0–4 балла), G. vaginalis/Prevotella spp. (0–4 балла) и Mobiluncus spp. (изогнутых палочек) (0–2 балла). При сумме > 10 баллов ставится диагноз «бактериальный вагиноз». Преимущества метода: позволяет понять соотношение лактобацилл и другой флоры. Недостатки: необходимость в микроскопических навыках, большое время для подсчета бактерий, затрудненная клиническая интерпретация промежуточных состояний, малое освоение в лабораториях.

Микроскопический метод в соответствии со шкалой Ison/Hay (2002) позволяет с помощью микроскопии более полно отразить состояние вагинальной флоры, чем баллы Nugent, с помощью окрашенного по Граму образца. В рамках данной методики описывают не только морфотипы бактерий, ассоциированных с БВ, но и другие возможные варианты нарушений микробиоты влагалища. Ответ выдается в виде степени нарушения микробиоты от 0 (отсутствие бактерий и клеточных элементов) до 4 (микробиота, состоящая из Гр+ кокков). Степень III соответствует БВ. Преимущества: метод имеет более широкий диапазон категорий, позволяющих более точно характеризовать состояние микробиоты влагалища.

В настоящее время разрабатываются тесты для ускоренной диагностики БВ в амбулаторных условиях, не требующие микроскопического исследования и являющиеся менее трудоемкими. В частности, за счет своей простоты, скорости и высокой специфичности (98%) нашел признание набор BV ® Blue Kit (OSOM BVBlue) для экспресс-диагностики БВ, позволяющий определить активность вагинальной сиалидазы (≥ 7,8 Ед), вырабатываемой G. vaginalis, Prevotella spp., Bacteroides и Mobiluncus spp. [56]. Результат можно получить через 10 мин с помощью реакции специфической относительной амплификации: при наличии сиалидазы цвет реагента меняется на синий или зеленый.

Также разработано другое экспресс-исследование — тестовая карта FemExam (Cooper Surgical), позволяющая определить pH влагалища и уровень триметиламина — побочного продукта метаболизма G. vaginalis (карта 1) и измеряющая активность пролин-аминопептидазы G. vaginalis (карта 2). Комбинированная чувствительность и специфичность составляют соответственно 91 и 61,5%; время исследования — 5 мин. В США применяется редко вследствие низкой специфичности; кроме того, тест не учитывает наличие других БВ-ассоциированных бактерий [57].

Молекулярно-биологические методы для определения ДНК БВ-ассоциированных микроорганизмов

Методы молекулярной диагностики находят большое применение в клинической практике, в том числе и в выявлении БВ. Разработка разнообразных методик стала отличным дополнением культурального исследования ввиду сложности обеспечения оптимальных условий для роста всех ассоциантов БВ. Кроме того, молекулярные методы позволяют определить количество и соотношение микроорганизмов в общей бактериальной массе, что играет ключевую роль в диагностике БВ.

Активное развитие получили методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (nucleic acid amplification tests, NAATs), в первую очередь количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Учитывая полимикробную природу БВ, желательно одновременно амплифицировать более одной целевой последовательности, поэтому сегодня количественные мультиплексные ПЦР-анализы, направленные на одновременное обнаружение сразу нескольких видов бактерий, набирают большую популярность в лабораторной диагностике. Мультиплексная ПЦР включает в себя уникальные наборы праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, которые связываются с участками гена 16S рРНК для обеспечения быстрой и простой альтернативы методам оценки количества копий генов или уровней экспрессии [13]. В Российской Федерации зарегистрированы и применяются мультиплексные ПЦР-тесты в реальном времени: Фемофлор-16 (определение тяжелого анаэробного дисбиоза с чувствительностью 99% и специфичностью 93%) [26], AmpliSens® Флороценоз/Бактериальный вагиноз-FRT (чувствительность и специфичность теста — 100% и 91% соответственно по сравнению с критериями Амселя). Важно также отметить, что часто наличие ДНК G. vaginalis воспринимается как достаточное основание для постановки диагноза «бактериальный вагиноз», что в корне неправильно, поскольку данный микроорганизм может встречаться во влагалище здоровых женщин в 5–60% случаев [56], и только его наличие не говорит о наличии у женщины БВ. Можно считать, что бактериальное разнообразие и общее снижение численности рода Lactobacillus spp. могут служить достаточными молекулярными маркерами для определения БВ у большинства пациенток [13].

Другим методом, используемым для молекулярной диагностики БВ, является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), которая позволяет одновременно оценить состав бактериальных таксонов и их пространственное расположение. Данный цитогенетический метод идентификации микроорганизмов-мишеней основан на обнаружении 16S рРНК, которая в большом количестве копий (10³–10⁵) присутствует в рибосомах бактериальных клеток и содержит видо-, группоспецифичные и универсальные бактериальные сегменты [26]. В результате комплементарного связывания флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов-мишеней с рибосомной РНК неповрежденной клетки проводится анализ под флуоресцентным микроскопом. FISH на сегодняшний день является единственным методом исследования, позволяющим выявлять биопленки, их видовой состав и связь бактерий друг с другом и с эпителиальными клетками (адгезивное или дисперсное состояние), что, безусловно, делает данный метод ценным.

В высокоспециализированных лабораториях применяются методы мультиплексного секвенирования нового поколения (NGS), в том числе Illumina и 454-секвенирование, позволяющие полностью и точно определить состав микробиоты влагалища [13]. С момента своего внедрения этот метод считается одним из самых точных среди всех молекулярно-генетических анализов и обладает высокой разрешающей способностью для определения видов и штаммов путем расшифровки генов бактериальной 16S рРНК. Из-за ограничений, связанных с техническим обеспечением, метод не применяется в рутинной лабораторной диагностики БВ. В ряде исследований применялись также анализ микрочипов на основе олигонуклеотидов из гена 16S рРНК и IS-профилирование, основанное на определении межгенных спейсеров 16S–23S рРНК для нахождения составляющих влагалищной микробиоты [58].

Матрично-активированная лазерная десорбция/ ионизация с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF MS) — технология, появившаяся в последние годы для идентификации микроорганизмов путем анализа их матричных белковых профилей. Метод широко используется в качестве быстрого и высокоточного аналитического инструмента для идентификации бактерий и грибов, выделенных в лабораторных условиях или непосредственно из образцов (посевы крови, спинномозговая жидкость, моча). Использование MALDI-TOF MS в образцах из влагалища для определения белковых профилей БВ показало высокую специфичность 95,3% [59], что, в свою очередь, может стать недорогой, практичной и менее трудоемкой альтернативой ПЦР.

Перспективные подходы к лечению бактериального вагиноза

Высокая частота рецидивов БВ объясняется развитием устойчивости бактерий к спектру применяемых антибиотиков и наличием биопленки, которая значительно затрудняет эрадикацию возбудителей и снижает биодоступность антибиотиков [42]. Поэтому лечение БВ должно быть комплексным и преследовать несколько целей, таких как дестабилизация биопленок, этиотропная антибактериальная терапия с учетом чувствительности возбудителей и восстановление естественного микробиома репродуктивного тракта.

Этиотропная терапия БВ предусматривает применение антибактериальных препаратов, в частности метронидазола и клиндамицина; существуют схемы с использованием орнидазола, азитромицина, применяемых в разных лекарственных формах (капсулы, крем, гели, суппозитории) и комбинациях. Несмотря на эффективность данной стратегии при ликвидации симптомов инфекции, в долгосрочной перспективе в большинстве случаев наблюдаются рецидивы. Поэтому международные рекомендации CDС предусматривают второй этап терапии, направленный на восстановление биоценоза влагалища [57].

Лекарственные средства для восстановления здоровой микробиоты представлены группами пробиотиков, пребиотиков и препаратами «закислителей». Фенотипические свойства лактобацилл, а именно их адгезия, агрегация, способность продуцировать молочную кислоту и перекись водорода, способствовали их выдвижению в качестве приоритетных защитных штаммов [60]. Препараты пробиотиков содержат непосредственно живые штаммы Lactobacillus spp.: в недавнем рандомизированном контролируемом исследовании продемонстрирован эффект порошка со штаммом L. crispatus CTV-05 для интравагинального введения после терапии метронидазолом: согласно заявлениям авторов, применение порошка существенно снижало частоту рецидивов БВ в течение 24 нед после лечения [61]. Другое исследование in vitro показало, что виды Lactobacillus способны ингибировать образование биопленки Gardnerella и уменьшать биомассу предварительно сформированной биопленки. При использовании L. rhamnosus процент снижения образования биопленки был выше, чем при использовании L. casei [62]. Тем не менее применение пробиотиков не отражается на снижении частоты рецидивов БВ при контроле через 6 мес.

Пребиотики служат источником питательных веществ для определенных видов и рассматриваются для стимуляции роста полезной микробиоты влагалища. Исследовательский интерес направлен на применение лактитола, лактулозы, раффинозы, олигофруктозы, мальтозы. Так, мальтозный гель индуцирует пролиферацию лактобацилл, следствием чего является ингибирование БВ-ассоциированных бактерий во влагалищной среде [63]. Кроме того, имеется дозозависимый эффект пребиотика лактоферрина в подавлении роста Gardnerella spp., а также наблюдается синергический эффект сочетания лактоферрина с клиндамицином [64]. Недавний обзор исследований с использованием пробиотиков/пребиотиков в комбинации с антибиотиками при БВ доказывает большую эффективность в снижении рецидивов, чем применение только первого этапа терапии в виде антибиотиков [65].

Существенную роль в патогенезе БВ играет pH влагалищной среды, и подкисляющие средства могут рассматриваться в качестве патогенетической терапии для ингибирования роста анаэробной микробиоты. Исследуются интравагинальные гели молочной кислоты (частота рецидивов в течение 6 мес аналогична применению метронидазола [66]).

Щит биопленки, создаваемый бактериями, призван предотвращать проникновение и биодоступность лекарственных препаратов, и большая часть актуальных исследований направлена на попытки снизить ее защитные механизмы. В частности, развивается направление терапии пептидогликангидролазами, вырабатываемыми бактериофагами: данные ферменты обладают чрезвычайно узким литическим спектром в отношении G. vaginalis и показывают многообещающие результаты в разрушении биопленки [67]. G. vaginalis представляет собой удобную мишень для эндолизинов, поскольку у нее нет внешней мембраны, а пептидогликановая клеточная стенка открыта и доступна для расщепления этими ферментами. Кроме того, эндолизин эффективен даже против против штаммов Gardnerella, устойчивых к метронидазолу [68], что в перспективе позволит минимизировать проблему антибиотикорезистентности. Существенным плюсом продуктов бактериофагов является отсутствие действия на нормальную микробиоту влагалища [68]. Однако высокая специфичность в отношении одного вида неэффективна в отношении комбинированных биопленок с F. vaginae и P. bivia, что позволяет рассматривать эндолизины только в качестве дополнительного средства к противомикробной терапии [69].

К новым многообещающим подходам к лечению БВ также относится трансплантация вагинальной микробиоты, подразумевающая инокуляцию влагалищных выделений от здорового донора во влагалище женщины с БВ. В недавнем исследовании у четырех из пяти участниц с рецидивирующим БВ после трансплантации наблюдалась долгосрочная ремиссия от 5 до 21 мес с восстановленным микробиомом, в котором доминировали лактобациллы [70]. Однако данный метод требует дальнейших исследований и клинических испытаний, особенно у реципиентов с ослабленным иммунитетом.

Отдельный блок дискуссий среди исследователей включает вопросы о целесообразности лечения бессимптомного течения БВ, а также необходимости лечения полового партнера. Все эти аспекты требуют дополнительных исследований и выработки единой стратегии ведения пациенток с БВ.

Заключение

Таким образом, БВ является многофакторным заболеванием, на развитие и течение которого влияют социальные, эпидемиологические, микробиологические и физиологические факторы. Несмотря на то, что классические представления о патогенезе, диагностике и лечении БВ сохраняют свои позиции в науке, в данный момент уже происходит сдвиг в глобальном понимании вагиноза с точки зрения микроэкологических принципов. Прежде всего это отражается в осознании сложной роли отдельных представителей микробиологического сообщества урогенитального тракта, значение которых для развития БВ долгое время оставалось неоднозначным. Для создания более эффективных стратегий ведения пациентов с БВ необходимо постепенно переходить от оценки общего микробиологического баланса к более индивидуализированным подходам, основанным на оценке значимости отдельных микроорганизмов, а также на изучении их факторов патогенности, антибиотикорезистентности, способности к образованию биопленок (в том числе в ассоциациях с другими характерными для БВ микроорганизмами) и характере синергических и антагонистических связей в рамках микробиологического сообщества при БВ.

Представление о микробиоме влагалища в норме и при дисбиозах, а также понимание факторов патогенности отдельных представителей вагинальной флоры и возможного взаимодействия микроорганизмов с образованием биопленок позволят расширить подходы к диагностике и лечению БВ. В силу нерешенности многих вопросов и споров вокруг этой проблемы БВ будет оставаться актуальной темой в медицинском сообществе.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Рукопись подготовлена и опубликована за счет финансирования по месту работы авторов.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. М.М. Сатуева — разработка концепта, поиск литературы и набор данных, анализ данных, написание первичного варианта статьи, одобрение финального варианта статьи; А.В. Лямин — разработка концепта, анализ данных, редактирование статьи, одобрение финального варианта статьи; А.В. Колсанова — разработка концепта, анализ данных, редактирование статьи, одобрение финального варианта статьи; М.П. Жилкина — поиск литературы и набор данных, анализ данных, написание первичного варианта статьи, одобрение финального варианта статьи; Д.В. Алексеев — поиск литературы и набор данных, анализ данных, написание первичного варианта статьи, одобрение финального варианта статьи. Все авторы статьи внесли существенный вклад в организацию и проведение исследования, прочли и одобрили окончательную версию рукописи перед публикацией.

About the authors

Madina M. Satueva

LLC Polyclinika.ru

Email: madina20991@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-2996-0019
Russian Federation, Moscow

Artem V. Lyamin

Samara State Medical University

Email: a.v.lyamin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-5905-1895
SPIN-code: 6607-8990

MD, PhD, Assistant Professor

Russian Federation, Samara

Anna V. Kolsanova

Samara State Medical University

Email: a.v.kazakova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9483-8909
SPIN-code: 5129-5915

MD, PhD, Assistant Professor

Russian Federation, Samara

Maria P. Zhilkina

Samara State Medical University

Email: jilkina.masha@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-3400-300X
SPIN-code: 5728-0366
Russian Federation, Samara

Dmitriy V. Alekseev

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: d.v.alekseev@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8864-4956
SPIN-code: 6991-8918

Laboratory Specialist

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files