Development and implementation of personalized technologies for reproductive disorders

Full Text

Введение

Решение демографической проблемы, повышение рождаемости, продолжительности жизни и снижение смертности определены Указом Президента России в качестве национальных целей государства на период до 2030 г. и на перспективу до 2036 г. (http://www.kremlin.ru/events/president/news/73986). Нарушения репродуктивной функции (бесплодие, невынашивание беременности, наследственная и врожденная патология), отложенное материнство и отцовство представляют собой глобальную проблему и оказывают мощное негативное влияние на демографические показатели государства, качество жизни российских семей. Охрана репродуктивного здоровья является приоритетом национальных проектов, развития системы здравоохранения и медицинской науки.

Сегодня рождение ребенка в супружеской паре с патологией репродуктивной системы в большинстве случаев является результатом применения индивидуальной медицинской стратегии, подразумевающей использование клеточных, омиксных технологий, методов регенеративной медицины, а также биобанкирования. В ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» (Институт), старейшем научном медицинском учреждении, основанном в 1797 г., в последние годы были проведены значимые исследования по следующим основным направлениям:

• отработка систем прогнозирования эффективности овариальной стимуляции;
• применение новых платформ оценки гамет;
• разработка доимплантационных тест-систем развития эмбрионов in vitro;
• диагностика и терапия дисфункции эндометрия;
• разработка генно-инженерных терапевтических конструкций при наследственных заболеваниях и гинекологической патологии;
• разработка анте- и постнатальных диагностических систем наследственных заболеваний.

Разработки в области экстракорпорального оплодотворения

Большинство пациентов, прибегающих к технологиям вспомогательной репродукции, к сожалению, имеют неоптимальный для реализации репродуктивной функции возраст, сниженный овариальный резерв, низкое качество гамет. Повысить эффективность лечения бесплодия в этих группах пациентов позволяют прогнозирование эффективности гонадотропной стимуляции яичников в циклах экстракорпорального оплодотворения, применение модифицированных протоколов с использованием соматотропного гормона, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) и других фармакологических агентов, оценка биологического профиля фолликулярной жидкости яичников с использованием омиксных технологий [1–11]. Для развития направления по сохранению фертильности пациенток c онкологическими заболеваниями разрабатывается способ извлечения гамет из удаленного яичника.

Современные платформы оценки гамет позволяют разработать программы реабилитации пациентов, выбрать направление медикаментозной коррекции, определить необходимость/эффективность хирургического способа получения гамет, выбрать программу вспомогательных репродуктивных технологий, способ оплодотворения, применеять преимплантационное генетическое тестирование эмбриона, определить план сохранения беременности. К таким платформам можно отнести детекцию нарушения процесса протаминирования хроматина, эпигенетической программы сперматозоидов, целостности ДНК, возникновение анеуплоидий, метод оценки длины теломер в сперматогенных клетках [12–14].

Доимплантационные тест-системы и мониторинг развития эмбрионов in vitro позволяют отработать индивидуальную стратегию реализации репродуктивной функции, в том числе у пациенток старшего репродуктивного возраста, с аномалиями кариотипа, а также при высоком риске рождения ребенка с тяжелыми моногенными заболеваниями. Доказана сопоставимость применения лабораторных платформ для преимплантационного генетического тестирования на анэуплодии (сравнительная геномная гибридизация, секвенирование нового поколения), применены системы диагностики моногенной патологии у эмбрионов (более 100 тест-систем), разработан алгоритм преодоления бесплодия у супружеских пар, имеющих структурные перестройки картиотипа. Так, с помощью метода сравнительной геномной гибридизации и секвенирования нового поколения доказано, что у женщин-доноров до 35 лет эуплоидный статус имеет почти 70% эмбрионов, у пациенток с бесплодием в 34–36 года — 48%, в 40–42 года — 30%, после 43 лет — только 10–13% [15–18]. После 30 лет наблюдается рост частоты простых анеуплоидий, анеуплоидий по двум и более хромосомам, после 37 лет — комплексных анэуплоидий.

В генезе нарушений имплантации, развития беременности, невынашивания и других осложнений, обусловленных нарушением плацентации, большую роль играет нарушение морфофункциональной трансформации эндометрия («дисфункция эндометрия» или «рефрактерный эндометрий»). В течение последних лет разработаны морфологическая панель и критерии диагностики дисфункции эндометрия, количественные показатели диагностики хронического эндометрита, предложена классификация степени его выраженности, определена взаимосвязь с микробиотой [19–22]. Для диагностики хронического эндометрита была использована иммуногистохимическая детекция комбинации маркеров (CD8+, CD20+, CD4+, CD138+) и экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону. Более того, определены варианты морфологической картины эндометрия после применения вспомогательных репродуктивных технологий в зависимости от полноценности гравидарной трансформации желез и стромы [23–25], создан способ диагностики рецептивного профиля рецептивности в абортном материале беременности раннего срока, что важно для выполнения программ реабилитации перед планированием последующих беременностей.

При невынашивании беременности и отсутствии имплантации в протоколах ЭКО для определения иммунологической составляющей в клиническую практику внедрены диагностические тесты цитотоксической активности NK-клеток пациентки по отношению к трофобласту [26–32]. Для прогнозирования индивидуального эффекта эндотелиопротективных фармакологических препаратов, использующихся при терапии привычного невынашивания беременности, а также при антифосфолипидном синдроме апробирован метод оценки их цитопротективного эффекта.

При бесплодии, ассоциированном с тяжелыми поражениями эндометрия, отрабатывается создание липосомальной лекарственной формы гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, сформирована технология трансплантации в полость матки клеточного продукта на основе аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [33–38], что привело к увеличению частоты наступления беременности и родов у группы тяжелых пациенток, а также позволило избежать применения программы суррогатного материнства.

С целью оценки и прогноза межклеточных взаимодействий в области контакта эндометрий–трофобласт применены искусственные интеллектуальные системы, в том числе метод глубокой семантической сегментации изображений. Разработана технология формирования трехкомпонентной клеточной сокультуры (3D-модель кокультивирования клеток трофобласта (JEG-3), NK-клетокs (NK-92), эндотелиальных клеток (Ea.Hy926), моноцитов (THP-1) на коллагеновом матриксе), представляющая собой квазитканевую структуру плаценты человека [39, 40]. Этот подход может быть использован для оценки влияния модифицирующих факторов на ранних сроках беременности, а также развития систем культивирования эмбрионов в программах экстракорпорального оплодотворения. Проведенные исследования позволили создать инновационную модель развития эмбриона человека in vitro до 19-го дня развития. Предложен модифицированный компонент для среды при таком культивировании — клетки гетерологичного эндометрия. Данное направление может явиться началом формирования базы референц-матриц эмбриоподобных структур [41].

Разработка генно-инженерных терапевтических конструкций при наследственных заболеваниях и гинекологической патологии

Перспективное направление работы — создание принципиально новых подходов к лечению наиболее частых гинекологических заболеваний, оказывающих существенное влияние на реализацию репродуктивной функции женщины, являющихся причиной бесплодия, невынашивания, неэффективных протоколов ЭКО, нарушений менструальной функции, а именно миомы матки и генитального эндометриоза. До настоящего времени не существует эффективных фармакологических препаратов, позволяющих стабилизировать рост миомы матки на долговременный период, в том числе для реализации репродуктивной функции. Разработка генно-инженерных терапевтических конструкций для лечения миомы матки является перспективным направлением в данной области. Так, на основе лиганд-конъюгированных цистеин-богатых пептидных носителей предложены системы доставки ДНК для направленной доставки гена тимидинкиназы HSV-1 в клетки и ткани миомы матки («суицидная терапия» опухоли). Для отработки технологии была разработана релевантная клеточная модель лейомиомы матки [42–44], определены физико-химические свойства, цитотоксичность, эффективность трансфекции и специфичность терапевтических комплексов. Разработанная клеточная модельная система может также стать инструментом оценки влияния половых стероидных гормонов на процессы мутагенеза, канцерогенеза, трансформацию опухолевой ткани. Преимуществами цистеин-богатых пептидных носителей выступают биодеградирумость, отсутствие ограничения на размер доставляемого вектора экспрессии (генетической конструкции), модульный принцип строения носителя, возможность модификации различными функциональными участками (лигандами, эндосомолитическими агентами, сигналами ядерной локализации и т.д.), а также быстрое высвобождение генетической конструкции в клетке из состава комплексов с цистеин-богатыми носителями, что снижает токсический эффект трансфекции по сравнению с другими высокомолекулярными полимерами.

Последние годы характеризуются возрастанием частоты генитального эндометриоза, в том числе его тяжелых форм. Заболевание сопровождается не только нарушением репродуктивной функции, но и болевым синдромом, нарушением функции смежных органов, что существенно снижает качество жизни пациенток. Комбинированное лечение заболевания предусматривает сочетание хирургических методик с назначением препаратов, угнетающих функцию яичников и оказывающих системные изменения, связанные с гипоэстрадиолемией. Сегодня в мире проводятся исследования более 100 фармакологических агентов для лечения эндометриоза. В экспериментальных условиях на модельных животных разработан один из возможных подходов — направленная доставка малых интерферирующих РНК в эндометриоидные импланты с помощью модульных пептидных носителей [45].

Анте- и постнатальные диагностические системы наследственных заболеваний

В течение последних лет в Институте созданы оригинальные отечественные технологические разработки в области профилактики, терапии и мониторинга эффективности лечения врожденных и наследственных заболеваний: неинвазивный пренатальный тест (НИПТ), набор для скрининга новорожденных детей на спинальную мышечную атрофию «НЕВА-ТЕСТ» (Genome-X SMA/ TREC/KREC testing kit), экспресс-тест-система для пренатальной диагностики хромосомной патологии методом КФ-ПЦР (Trisomy Detection Express, T-Dex), а также генно-инженерные решения при тяжелых орфанных заболеваниях — спинальной мышечной атрофии и миодистрофии Дюшенна.

НИПТ основан на детекции фетальной ДНК в крови беременной женщины методом высокопроизводительного секвенирования, имеет собственный биоинформатический алгоритм, обладает высокой чувствительностью и специфичностью (> 99,0%), сочетается с реагентами российских производителей. Тест имеет перспективы развития в аспекте скрининга митохондриальных заболеваний, больших акушерских синдромов, а также обнаружения ДНК вирусов и бактерий. Тест апробирован более чем в 30 городах Российской Федерации [46–48].

Особенностью отечественной диагностической системы «НЕВА-ТЕСТ» является способность к детекции не только больных детей, но и носителей мутации гена спинальной мышечной атрофии. Это дает возможность спустя несколько десятилетий создать уникальную стратегию для осуществления репродуктивной функции у людей с мутацией и предотвратить появление у них детей, страдающих от этого заболевания [49, 50].

Экспресс-тест-система для пренатальной диагностики хромосомной патологии T-Dex, основанная на количественной полимеразной цепной реакции с флуоресцентно меченными праймерами и микросателлитным анализом, позволяет осуществить детекцию трисомий 21, 13, 18, числовых нарушений половых хромосом. Ее отличает сокращение скорости технологического процесса по сравнению со стандартным подходом в 5 раз. Данная лабораторная платформа создана на основе отечественных реагентов и сочетается с другими реагентами отечественного производства [51].

Генно-инженерные решения в области лечения спинальной мышечной атрофии заключались в отработке системы антисмысловых нуклеотидов в комплексе с пептидными носителями для доставки в культуры клеток больных, оценке физико-химических свойств, токсичности и эффективность трансфекции гена. Технология оценки эффективности генотерапии спинальной мышечной атрофии базируется на количественном флуоресцентном анализе на основе количественной ОТ-ПЦР, позволяет оценивать эффективность терапевтических конструкций, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN, точно определить долю полноразмерных транскриптов FL-SMN (молекулярного биомаркера спинальной мышечной атрофии) [52, 53]. Разработка технологий мониторинга эффективности лечения заболевания важна, поскольку имеются перспективы выхода на российский рынок новых препаратов, а также появления дженериков. Система направленной доставки генов — электростатически стабилизированных ДНК-пептидных наночастиц — была предложена в качестве эффективного средства переноса гена GFP в мышечные волокна экспериментальных животных C57BL/10J mdx при миодистрофии Дюшенна.

Стратегическим направлением научных исследований является биобанкирование. В 2023 г. открыт репродуктивный биобанк «Генофонд», способствовавший развитию одного из важнейших направлений — созданию национальной базы данных геномной информации с максимальной мощностью 300 тыс. единиц хранения. Для пользователей биобанка создано отечественное программное обеспечение деятельности данной структуры, в том числе внедрены в работу информационные системы хранения и мониторинга данных. Сформированы уникальные рабочие базы — невынашивания беременности (не имеет аналогов в мире) и микро-РНК тяжелой акушерской патологии (преэклампсии, преждевременных родов, гестационного диабета, задержки роста плода). Материалы биобанка позволяют проводить разработки в области биоинформатики. Важным направлением стала разработка программ криоконсервации и долговременного хранения женского и мужского репродуктивного материала, в том числе гамет, эмбрионов, биоптатов гонад. Это имеет принципиальное значение для реализации репродуктивной функции у пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями, а также имеющих профессии, связанные с угрозой здоровью и жизни (военнослужащие, участники СВО, жены участников СВО), работающих вахтовым методом (арктические регионы страны), а также при отложенном материнстве/отцовстве [54–57].

В Институте сформирована уникальная коллекция репродуктивно значимых микроорганизмов. Она включает три основных блока: представителей нормальной микробиоты; условно патогенные микроорганизмы с генами моно- и полирезистентности к антибактериальным препаратам, антисептикам и бактериофагам; биопленкообразующие штаммы бактерий с результатами действия химиотерапевтических препаратов на бактериальные пленки; группы патогенных и условно патогенных микроорганизмов, дрожжеподобных грибов и вирусов [58–60]. Материалы коллекции могут быть использованы для исследования фенотипических, генотипических характеристик микроорганизмов, факторов вирулентности и патогенности, антибиотикорезистентности, мониторинга возбудителей инфекций в регионе Санкт-Петербурга, а также связанных с оказанием медицинской помощи.

Заключение

Таким образом, результаты научных изысканий, ставшие основой медицинских технологий, позволяют сформировать персонализированную стратегию для семьи при нарушениях репродуктивной функции, повысить эффективность преодоления бесплодия, невынашивания беременности, программ вспомогательной репродукции, профилактировать тяжелые акушерские и перинатальные осложнения.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Рукопись подготовлена и опубликована за счет финансирования по месту работы автора.

Конфликт интересов. Автор данной статьи подтвердил отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

About the authors

Igor Y. Kogan

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Author for correspondence.
Email: ikogan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7351-6900
SPIN-code: 6572-6450

MD, PhD, Professor, Corresponding Member of the RAS

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files