Use of the Highly Attenuated Vaccinia Virus, Strain NYVAC, as Recombinant Vector for Construction Vaccine Against HIV Infection

Full Text

Введение

Высокоаттенуированный вирус осповакцины, штамм NYVAC (New York vaccinia virus), нуклеотидная последовательность которого была полностью определена, выделен из клонированной бляшки (VC-2) вируса осповакцины, штамм Копенгаген [1].

NYVAC получен за счет делеций 18 открытых рамок трансляции, кодирующих вирулентность и круг хозяев, но не затрагивающих репликацию вируса в ряде культур клеток. NYVAC индуцирует слабый противооспенный иммунный ответ даже после двукратной иммунизации. Кроме того, у вырабатываемых антител были и качественные различия [2], поэтому он вряд ли будет массово использоваться как противооспенная вакцина.

Для вируса осповакцины, штамм NYVAC, практически не наблюдалось продуктивной репродукции в целом ряде испытанных клеточных линий человека (MRC-5, WISH, Detroit, HEL, JT-1, HNK), мышей, свиней, собак и лошадей [3]. Репродукция вируса осповакцины, штамм NYVAC, в этих клетках блокируется на поздних стадиях развития, на этапе сборки вируса, когда синтезированы все антигены встроенных генов [4]. Все эти свойства обеспечивали возможность использования вируса осповакцины, штамм NYVAC, как безопасной векторной системы для экспрессии чужеродных генов для лиц с нарушениями здоровья, особенно с иммунодефицитными состояниями, вызываемыми в основном ВИЧ (вирус иммунодефицита человека; Immunodeficiency Virus, HIV).

Иммунный ответ, индуцируемый при применении только рекомбинантного вируса осповакцины, штамм NYVAC

Первые эксперименты по применению рекомбинантного вируса NYVAC, экспрессирующего белки — gp120 и Gag-протеазу ВИЧ, были выполнены при иммунизации макак, в последующем инфицированных ВИЧ-2. Результаты показали безопасность этого вектора и влияние сроков иммунизации на выработку защитного иммунитета, который, однако, не защищал от дальнейшего инфицирования. Сокращение сроков иммунизации с 17 до 6 мес приводило к снижению защитной эффективности [5].

В другом исследовании вакцина NYVAC-SIV_env, экспрессирующая антигенные детерминанты оболочки ВИО (вирус иммунодефицита обезьян; Simian immunodeficiency virus, SIV), не защищала иммунизированных макак после внутривенного заражения высоковирулентным штаммом ВИО (SIV_mac251), но удлиняла сроки жизни нескольким животным. У одного из них срок жизни увеличился до пяти лет [6].

Иммунизация макак рекомбинантным вирусом вакцины, штамм NYVAC, экспрессирующим те же gag-, pol- и env-белки SIV [7] с одновременной коэкспрессией интерлейкина-12 (IL-12), индуцировала гуморальный и клеточный иммунный ответ. При дальнейшем заражении обезьян SIV_mac251 выявлено, что вакцинация NYVAC-SIV была способна только замедлить прогрессирование заболевания. Коэкспрессия IL-12 не оказывала влияние на эффективность вакцинации.

В дальнейшем были продолжены эксперименты по увеличению количества экспрессируемых белков встроенными генами за счет добавления лимфокинов, нарабатываемых также вектором NYVAC. На макаках проводилась оценка защитной эффективности вакцин на основе только рекомбинантного вируса осповакцины, штамм NYVAC, экспрессирующего белки генов gag, pol, env SIV_k6w (NYVAC-SIV), и его же при одновременной коэкспрессии α- и β-цепей IL-12 или IL-2. Установлено, что коэкспрессия IL-12 усиливает CD4⁺-специфический антивирусный иммунный ответ вакцины NYVAC-SIV, а добавление IL-12 или IL-12 + IL-2 во время иммунизации может даже снизить гуморальный иммунный ответ. После иммунизации всех макак заражали высокопатогенным SIV_mac251. Заболевание у инфицированных животных протекало медленнее, чем у контрольных макак [7].

Оценка иммунного ответа, индуцированного двумя рекомбинантными векторами NYVAC, экспрессирующими гликопротеины gII, gIII и gp50 вируса псевдобешенства, показала, что вируснейтрализующие антитела определялись у свиней только после двух инъекций рекомбинантных векторов. После заражения нативным вирусом заболели все вакцинированные и контрольные животные. Однако симптомы псевдобешенства, включающие анорексию, депрессию, рвоту, респираторные воспаления, у вакцинированных свиней были менее выраженными по сравнению с контрольными [8].

Помимо встраивания генов ВИЧ, SIV и псевдобешенства оценивалась возможность использования рекомбинантного вируса осповакцины, штамм NYVAC, для создания рекомбинантной вакцины против малярии [9]. После одного введения вакцинного препарата индуцировался умеренный иммунный ответ, который выходил на пиковые значения после второй вакцинации. Результаты иммунного ответа, индуцированного только рекомбинантным вектором NYVAC, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Результаты изучения иммунного ответа у макак резусов, индуцированного рекомбинантным вирусом вакцины, штамм NYVAC

Экспрессируемые гены	Вирус	Наличие заболевания после заражения  нативным вирусом	Результаты оценки иммунного oтвета	Литература
Вич-1mngp120 белок + Gag-протеаза	ВИЧ	Есть	Уменьшение длительности иммунизации приводит к уменьшению защиты	[5]
Белки-оболочки	ВИО		Удлинение срока жизни после заражения	[6]
Гликопротеины gII, gIII, gp50	Псевдобешенства		Экспрессируемые гликопротеины gII, gIII и gp50 вызывали образование нейтрализующих антител. После заражения нативным вирусом у всех свиней развились симптомы псевдобешенства, однако у вакцинированных животных они проявлялись в менее выраженной форме	[7]
Gag-, pol- и env-белки с коэкспрессией IL-2 человека. Gag-, pol- и env-белки с коэкспрессией IL-2 и IL-12 человека	ВИО	Есть	Медленное прогрессирование заболевания после заражения. Образование цитолитических T-лимфоцитов. Все вакцинированные животные заболели, более медленное течение заболевания после заражения	[8]
Семь антигенов на разных стадиях жизненного цикла	Возбудитель малярии	Нет	Защита против экспериментального заражения малярийными паразитами	[9]

 

Согласно полученным данным, иммунизация только одним вектором, рекомбинантным NYVAC, способна индуцировать иммунный ответ. Однако для такого заболевания, как СПИД, он не обладал защитным действием при дальнейшем заражении нативным вирусом. Защита против заболевания не коррелировала с наличием только нейтрализующих антител, что дает основание предполагать ключевую роль клеточно-опосредованного иммунитета для данного заболевания.

В связи с этим в дальнейшем при создании вакцины против ВИЧ-инфекции указанный вектор начали использовать в прайм-бустерной системе иммунизации. В качестве другого компонента этой системы иммунизации оценивалась рекомбинантная ДНК-вакцина. Основным ее преимуществом являлся тот факт, что на этот вектор не индуцируется иммунный ответ и не присутствует предсуществующий иммунитет.

Иммунный ответ, индуцируемый при применении только рекомбинантных ДНК-вакцин

Эксперименты по исследованию иммунных ответов, индуцированных ДНК-вакцинами со встроенными генами вирусных белков, давали неоднозначные результаты. Иммунизация мышей C3H/He и BALB/c плазмидным вектором, экспрессирующим гликопротеин вируса бешенства, индуцировала у них вируснейтрализующие антитела и гликопротеин-специфические цитотоксические Т-клетки. Вакцинированные мыши были защищены от заражения вирусом бешенства [10]. Подобные результаты иммунизации мышей BALB/c были получены при применении плазмидного вектора, экспрессирующего нуклеопротеин вируса гриппа типа А [11], лимфоцитарного хориоменингита [12].

Иммунизация макак резусов плазмидной ДНК, кодирующей SIV_mac env и gag гены, вызывала образование персистирующего SIV_mac-специфического ответа цитотоксических Т-лимфоцитов. Хотя подобная иммунизация не защищала животных от заражения нативным SIV_mac-вирусом, она свидетельствовала о возможности использования нуклеотидных векторов для создания на их основе вакцин при совместном использовании с другими векторами [13, 14].

Рекомбинантная ДНК-вакцина, экспрессирующая белки оболочки ВИЧ, индуцировала у макак-крабоедов гуморальный и клеточный специфические ответы. После инфицирования нативным вирусом одна из четырех иммунизированных обезьян была защищена от заболевания. У остальных результаты иммунизации проявились только в уменьшении вирусной нагрузки по сравнению с невакцинированными [14].

При иммунизации шимпанзе ДНК-вакциной, экспрессирующей белки env, rev, gag, pol ВИЧ-1, индуцировались гуморальный и клеточный иммунные ответы. После заражения нативным вирусом вакцинированные животные были защищены от инфицирования [15].

Экспериментальная вакцина, экспрессирующая различные комбинации и формы SIV_mac-белков, вызывала образование нейтрализующих антител и цитотоксических лимфоцитов к env-белку. Через 2 нед после последней вакцинации обезьян заражали высокопатогенным вирусом SIV_mac251. Было выявлено, что иммунизация ДНК-вакциной не защищает от заражения нативным вирусом [13, 16].

Результаты иммунного ответа, индуцированного рекомбинантными ДНК-вакцинами, которые экспрессируют иммунодоминантные вирусные антигены, представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Результаты иммунного ответа, индуцированного рекомбинантными ДНК-вакцинами

Животные	Экспрессируемые гены	Вирус	Наличие заболевания  после заражения нативным вирусом	Результаты иммунного oтвета	Литература
Мыши C3H/He BALB/c	Гликопротеин	Бешенствa	Нет	Индуцирование вирус-специфических Т-лимфоцитов, вируснейтрализующих антитела	[10]
Мыши BALB/c	Нуклеопротеин	Лимфоцитарного хориоменингита			[12]
		Гриппа		Нуклеопротеин-специфические цитотоксические Т-лимфоциты	[11]
Макаки-резусы	Env и gag	ВИО	Есть	Образование цитотоксических T-лимфоцитов. Все вакцинированные животные заболели	[13, 14]
Макаки Cyno molgus	Белки оболочки		Одна из обезьян защищена  от заболевания, остальные заболели	У одной обезьяны — индуцирование гуморального и клеточного иммунитета, у остальных — снижение вирусной нагрузки	[14]
Шимпанзе	Env-, rev-, gag-, pol-белки	ВИЧ	Нет	Все вакцинированные животные не заболели	[15]
Макаки-резусы	Нереплицирующиеся частицы и секретируемые формы оболочечных гликопротеинов	ВИО	Есть	Все вакцинированные животные заболели. Вирусная нагрузка уменьшалась до хронической за более короткое время в вакцинированной группе	[13, 16]

 

Таким образом, экспериментально было показано, что рекомбинантные ДНК-вакцины индуцируют гуморальный и клеточный иммунитет на экспрессируемые белки. Кроме того, результаты иммунного ответа, полученные с применением рекомбинантных ДНК-вакцин, содержащих иммунодоминантные антигены ВИЧ или ВИО, в некоторых экспериментах дали положительный результат по защите животных после заражения соответствующим нативным вирусом, что несколько противоречило результатам иммунизации рекомбинантным вектором NYVAC. Поэтому эксперименты по применению этих высокоаттенуированных рекомбинантных векторов были продолжены в прайм-бустерной системе иммунизации.

Применение рекомбинантного вируса осповакцины, штамма NYVAC, в прайм-бустерной системе иммунизации

Была проведена оценка различных схем иммунизации при применении рекомбинантных векторов NYVAC и ДНК-вакцин, содержащих иммунодоминантные гены разных вирусов. Так, на беличьих обезьянах оценивался иммунный ответ, индуцируемый вирусом Т-клеточной лейкемии/лимфомы человека типа 1 (Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus Type 1-HTLV-1) [17]. Оценивались две схемы иммунизации: первая включала в себя трехразовое праймирование рекомбинантным вектором NYVAC со встроенным env-геном (NYVAC-HTLV-1-env) на 0-й, 1-й, 3-й мес и одноразовое бустирование через 6 мес ДНК-вакциной со встроенным env-геном. Во второй схеме иммунизации праймирование проводилось одноразовым введением такой же ДНК-вакцины, а бустирование — через 6 мес трехразовым введением через каждый месяц рекомбинантного вектора NYVAC со встроенными генами env и gag. Все вакцинированные обезьяны через 2 мес после последнего бустирования были внутривенно заражены клетками, трансформированными HTLV-1.

Выявлено, что схема вакцинации, включающая праймирование ДНК-вакциной и бустирование рекомбинантным вирусом вакцины, штамм NYVAC, предпочтительна. Индуцированный иммунный ответ мало зависел от титра специфических антител и определялся в основном Т-клеточным иммунным ответом. Подобные результаты были получены в 1998 г. в эксперименте, в котором вирус осповакцины, штамм NYVAC, был заменен на вирус осповакцины, штамм MVA [18].

Положительный опыт этого эксперимента с применением в качестве праймирующего компонента ДНК-вакцины и бустирующего — рекомбинантного вектора NYVAC способствовал проведению исследований по сравнительной оценке иммунного ответа, индуцированного только рекомбинантным вирусом вакцины, штамм NYVAC, и ДНК-вакциной с рекомбинантным вектором NYVAC. В первом эксперименте праймирование осуществлялось рекомбинантным вектором NYVAC, экспрессирующим gag-, pol- и env-белки SIV, на 0-й и 4-й нед, бустирование этим же вектором — на 24-й и 52-й нед. В другом эксперименте макаки праймировались ДНК-вакциной, содержащей встроенные гены gag и env белков SIV, на 0-й, 4-й, 12-й нед и бустировались рекомбинантным вектором NYVAC на 24-й и 52-й нед. Добавление праймирующей ДНК-вакцины (DNA-ge) индуцировало значительное повышение лимфопролиферативного ответа CD8⁺ и CD4⁺ Т-клеток у макак по сравнению с применением только рекомбинантного вектора NYVAC-SIVgpe [19].

В клиническом испытании ЕV-02 фазы I, выполнeнном в рамках программы «Евровак» (EuroVacc program), сравнивались безопасность и иммуногенность вакцин, экспрессирующих env-, gag-, pol- и nef-антигены ВИЧ-1 клада С (при схемах ДНК-С праймирование / NYVAC-С бустирование) [20]. Показаны безопасность обеих вакцин и улучшенный полифункциональный и длительный иммунный ответ при схеме праймирования/бустирования.

Результаты иммунизации ВИЧ-неинфицированных волонтеров в клиническом испытании ЕV-03 по схеме ДНК-праймирование на 0-й, 4-й и 8-й нед / NYVAC-бустирование однократно на 24-й нед (оба вектора экспрессировали env-, gag-, pol- и nef-антигены ВИЧ-1 клада С) показали преимущество этой схемы по сравнению с иммунизацией только NYVAC-рекомбинантной вакциной, экспрессирующей те же антигены. При данной схеме иммунизации образовывались ВИЧ-специфические CD8⁺ и CD4⁺ Т-клетки в крови и кишечнике [21].

На макаках-резусах оценивались различные схемы иммунизации c применением одних и тех же векторов. Для праймирования использовались ДНК-вакцины, экспрессирующие gag-, pol-, nef-антигены и gp140 ВИЧ-1 клада С, для бустирования — рекомбинантный вектор NYVAC, экспрессирующий те же антигены, с добавлением белка gp120 и адъюванта MF59. Испытывались три схемы иммунизации: группа А — трехразовое применение праймирующих ДНК-вакцин (0-я, 4-я, 8-я нед); группа В — также трехразовое применение праймирующих ДНК-вакцин (0-я, 2-я, 4-я нед — ускоренная иммунизация); группа С — двухразовое применение праймирующих ДНК-вакцин (0-я, 4-я нед). Бустирование в каждой группе — двухразовое применение рекомбинантного вируса осповакцины, штамм NYVAC, с добавлением белкового компонента и адъюванта в различные периоды времени [22]. Результаты оценки индуцированных иммунных ответов в данном эксперименте были практически одинаковы, что позволяет использовать для индуцирования иммунного ответа упрощенную схему: только два ДНК-праймирования и одно бустирование рекомбинантным вектором NYVAC.

Две схемы иммунизации также отрабатывались на 147 ВИЧ-отрицательных волонтерах в многоцентровом исследовании EV03/ANRS фазы I/II. В первой группе из 74 волонтеров проводилось трехразовое праймирование ДНК-вакциной, экспрессирующей gag-, pol-, nef-, env-антигены и белок gp120 ВИЧ-1, на 0-й, 4-й, 8-й нед и одноразовое бустирование NYVAC-вакциной, экспрессирующей те же гены, на 24-й нед. Во второй группе праймирование осуществлялось двукратным введением ДНК-вакцины на 0-й и 4-й нед, бустирование — двукратным введением NYVAC-вакцины на 20-й и 24-й нед, экспрессирующей те же антигенные детерминанты, что и в первой группе [23].

Результаты иммунизации показали, что обе схемы вакцинации индуцировали ВИЧ-специфические CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки и Th1- и Th2-цитокины. У 81% вакцинируемых формировались специфические антитела. У волонтеров из первой группы развивался более широкий Т-клеточный ответ. Во второй группе было большее количество волонтеров с более высоким уровнем IgG против env-антигена. В данном испытании показано влияние схемы вакцинации на качество индуцированного иммунитета. Схема иммунизации, при которой env-белок и адъювант MF59 добавляются к праймирующей ДНК-вакцине, экспрессирующей так же, как и бустирующая NYVAC-вакцина, gag-, pol-, nef-антигены ВИЧ-1 клада С и белок gp140 в трехмерной форме, протестирована на макаках-резусах [24]. Было проанализировано пять различных схем вакцинации: праймирование ДНК-вакцинами или рекомбинантыми NYVAC-вакцинами, бустирование ДНК-вакцинами или рекомбинантыми NYVAC-вакцинами с добавлением белка gp140 или без него. Схемы проведения доклинических и клинических испытаний представлены в табл. 3, 4.

 

Таблица 3. Схемы проведения доклинических исследований с применением рекомбинантного вектора NYVAC в системе праймирования/бустирования

Животные	Вирус, гены которого встроены	Праймирование		Бустирование		Схема проведения	Предлагаемая  схема	Литература
		Вектор	Экспрес- сируемые  белки	Вектор	Экспрес- сируемые  белки
Беличьи обезьяны	Т-клеточной  лейкемии  человека	1 схема NYVAC	Env	1 схема ДНК-вакцина	Env	1 схема 3х прайм 1х буст	ДНК-вакцина- прайм NYVAC буст	[17, 18]
		2 схема ДНК-вакцина		2 схема NYVAC	Env, gag	2 схема 1х прайм 1х буст
Макаки- резусы	ВИО	1 схема NYVAC	Env, gag, pol	NYVAC	Env, gag, pol	1 схема 2х прайм 2х буст	2 схема 3х прайм 2х буст	[19]
		2 схема ДНК-вакцина	Env, gag	2 схема NYVAC	Env, gag, pol	2 схема 3х прайм 2х буст
	ВИЧ-1	ДНК-вакцина	Gag, pol, nef, env, gp140	NYVAC	gag, pol, nef, gp140, белок gp120, адъювант МF59	А группа: 3х прайм 2х буст. В группа: 3х прайм 2х буст. С группа: 2х прайм 2х буст	2x прайм 1х буст	[22]
		ДНК-вакцина  или NYVAC	Env, gag, pol, nef, gp140,  в трехмерной форме, адъювант MF59	ДНК-вакцина  или  NYVAC	Env, gag, pol, nef, gp140,  в трехмерной форме,  адъювант MF59	5 схема	ДНК-вакцина- прайм NYVAC буст NYVAC буст	[24]

 

Таблица 4. Схемы проведения клинических испытаний с применением рекомбинантных векторов NYVAC в системе праймирования/бустирования

Клиническое испытание	Вирус, гены которого встроены	Праймирование		Бустирование		Схема проведения	Предлагаемая  схема	Литература
		Вектор	Экспрессируемые  белки	Вектор	Экспрессируемые  белки
EV-02 Здоровые ВИЧ-отрицательные	ВИЧ-1	ДНК-вакцина	Env, gag, pol, nef	NYVAC	Env, gag, pol, nef	1х прайм 1х буст	1х прайм 1х буст	[20]
EV-03 ВИЧ-1 неинфицированные							3х прайм 1х буст	[21]
EV03/ANRS ВИЧ-1 неинфицированные			Gag, pol, nef, env,  gp120		Gag, pol, nef, env, gp120	А группа: — В группа: 2х прайм 2х буст	3х прайм- 1х буст	[23]

 

При всех схемах индуцировался широкий, полифункциональный и хорошо сбалансированный CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточный ответ [24]. Однако схема праймирования ДНК-вакциной вызывала более сильный иммунный ответ, чем праймирование рекомбинантной NYVAC-вакциной. Добавление белкового компонента к праймирующему вектору — ДНК-вакцине — и адъюванта MF59 рекомендовано для более быстрого формирования гуморального ответа при отсутствии негативного влияния на клеточные реакции [24]. Таким образом, применение схемы иммунизации «праймирование ДНК-вакциной / бустирование рекомбинантным вектором NYVAC» в доклинических и клинических испытаниях фазы I вызывало образование полифункционального длительного иммунного ответа.

Создание вакцины против ВИЧ-инфекции на основе вектора NYVAC

Хотя появление СПИДа датируется 1981 г., он быстро распространился на территории всех континентов, особенно в бедных странах, приняв размах пандемии. В 2021 г. 1,5 млн человек были впервые инфицированы ВИЧ-1; 38,4 млн жили с ВИЧ-1 и 650 тыс. умерли от сопутствующих заболеваний, связанных со СПИДом. Хотя успехи антиретровирусной терапии превратили такое заболевание, как СПИД, из некогда смертельной болезни в вяло прогрессирующее заболевание, оно по-прежнему остается одной из важнейших социально значимых инфекций [25]. Кроме того, разработка вакцин против ВИЧ- 1 осложняется отсутствием соответствующих моделей для точного индуцирования В- и Т-клеточного ответа человека в лимфоидных органах [26].

Учитывая, что в развивающихся странах проживает около 15–60% людей, живущих с ВИЧ-1, а антиретровирусная терапия недоступна, очевидно, что необходима эффективная вакцина. Идеальная вакцина против ВИЧ должна предотвращать диссеминацию вируса и контролировать его репликацию. Вакцинация у ВИЧ-инфицированных пациентов применяется для увеличения иммуноопосредованной элиминации персистентно ВИЧ-инфицированных CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток на протяжении длительной антиретровирусной терапии, что позволит безопасно прервать антиретровирусную терапию [27, 28].

Природного иммунитета против ВИЧ-инфекции нет. Репликация ретровирусов характеризуется высокой скоростью, и поэтому вирусы подвержены большой частоте спонтанных мутаций, что приводит к появлению антигенно измененных вариантов («ускользающих» мутантов), а распознаваемые ранее эпитопы перестают быть иммунодоминантными [29].

На сегодняшний день проведено восемь клинических испытаний вакцин против ВИЧ-инфекции [30, 31]. Однако умеренный протективный эффект (31,1%) получен лишь в единственном испытании фазы III RV144, проведенном в 2009 г. в Таиланде. В исследовании участвовало 16 395 гетеросексуальных мужчин и женщин при иммунизации векторной вакциной (ALVAC) на основе рекомбинантного вируса оспы канареек, экспрессирующего gag, протеазу и еnv-белки ВИЧ-1. Были проведены две вакцинации этим вектором и две вакцинации этим же вектором с добавлением к нему мономерного оболочечного белка AIDSVAX B/E gp120. Испытание длилось 42 мес, в течение которых волонтеры вели обычный образ жизни. По истечении этого срока наблюдения в контрольной группе из 8198 человек зафиксировано 74 новых случая заболевания ВИЧ-инфекцией, а в иммунизированной группе из 8197 человек — 51 [32].

Вирус оспы канареек относится к роду Avipoxvirus. Представители этого рода не проходят полный цикл репродукции в клетках млекопитающих: они их инфицируют, экспрессируют все необходимые белки, включая кодируемые встроенными генами, однако сборки вирионов не происходит. В связи с этим в последующем многие эксперименты преследовали цель заменить репликативно-дефектный вектор ALVAC на другой высокоаттенуированный вектор, который бы увеличивал количество встроенных антигенов. Поэтому были проведены исследования по сравнению иммуногенности, индуцированной рекомбинантными векторами NYVAC и ALVAC, экспрессирующими одни и те же встроенные гены ВИЧ-1 клада С: праймирование — оболочечный белок gp140 в трехмерной форме; бустирование — gag, pol, nef в виде полипротеина, процессируемого в gag-производное вирусоподобных частиц. Схема вакцинации была одинаковой для обоих векторов: двукратное праймирование и двукратное бустирование указанными рекомбинантными векторами с добавлением оболочечного белка gp120 ВИЧ-1 клада С. Помимо этого для сравнения были взяты рекомбинантные векторы ALVAC, используемые в испытании RV144.

Результаты этих исследований показали, что оба вектора индуцировали гуморальный и Т-клеточный ответы, однако рекомбинанты на основе вектора NYVAC были более иммуногенными, чем на основе ALVAC, индуцируя большее количество ВИЧ-1 специфических CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток и большее количество антител против gp140- и gp120-белков [33]. Эти результаты дали толчок дальнейшему развитию вакцин на основе вектора NYVAC. Эксперименты по оценке рекомбинантных векторов на основе NYVAC проводились с сохранением всех параметров испытания RV144 и заменой только вектора ALVAC на вектор NYVAC.

Таким образом, поскольку в клиническом испытании RV144 праймирование и бустирование осуществлялись одним и тем же вектором ALVAC, то в дальнейшем иммунный ответ, индуцированный в доклинических и клинических испытаниях, оценивался только рекомбинантами на основе вектора NYVAC. Поэтому были проведены эксперименты по оценке безопасности и силе иммунного ответа, индуцированного вирусом вакцины, штамм NYVAC.

Индуцирование иммунного ответа рекомбинантными векторами на основе вируса осповакцины, штамм NYVAC, при прайм/бустерной схеме иммунизации

В фазе I клинического испытания ЕV-01, проведенного на здоровых ВИЧ-отрицательных волонтерах, изучались вакцины, основанные на векторе NYVAC, экспрессирующие оболочечный gp120-белок для праймирования и gag-, pol-, nef-белки ВИЧ-1 клада С для бустирования. Результаты свидетельствовали о безопасности вакцин и запуске Т-клеточного иммунного ответа, причем в большинстве случаев против gp120-белка [34].

В клиническом испытании фазы I Theravac-01, проведенном на ВИЧ-инфицированных, принимающих антиретровирусную терапию волонтерах, также использовались векторы NYVAC, экспрессирующие те же белки ВИЧ-1, но клада В. Результаты показали безопасность этих векторов и высокую иммуногенность, о чем свидетельствовали увеличение предшествующего Т-клеточного иммунного ответа и вновь определяемые ВИЧ-специфические CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки, причем больше индуцировалось полифункциональных gag-специфических Т-клеток [35].

Поскольку добавление белкового компонента для бустирования в испытании RV144 давало положительный эффект, было проведено исследование на макаках-резусах о влиянии на иммуногенность оболочечного белка gp120 SIV-1 в качестве бустерного компонента при праймировании рекомбинантным вектором NYVAC, экспрессирующим тот же оболочечный белок gp120. Было показано образование большого количества полифункциональных антител, но в основном невируснейтрализующих [36].

Получение и оценка репликативно-компететных векторов NYVAC

Как уже указывалось, для увеличения количества экспрессируемых белков ВИЧ необходимо применение высокоаттенуированного репликативно-компетентного вектора. С этой целью был модифицирован родительский вирус осповакцины, штамм NYVAC, который содержит 18 делетированных генов, определяющих вирулентность и круг хозяев вируса. Для получения репликативно-компетентного в клетках человека родительского рекомбинантного вектора NYVAC в его геном встраивались два ранее делетированных гена — K1L и C7L, с образованием рекомбинантного вектора NYVAC-C-KC, который реплицировался в человеческих кератиноцитах и дермальных фибробластах. Повторное встраивание генов диапазона хозяина C7L и K1L в геном вектора NYVAC привело к усилению экспрессии антигенов ВИЧ-1 in vitro, активации путей, участвующих в процессинге и презентации антигена, усилению перекрестной презентации ВИЧ-1-специфичным CD8⁺ Т-клеткам и пролиферации ВИЧ-1-специфичных CD8⁺ Т-клеток памяти in vitro [38, 39]. Кроме того, с целью получения варианта, обладающего усиленными иммунологическими свойствами, в геном вектора NYVAC вводили делеции либо одного гена B19R, который кодировал интерферон-связывающий белок типа I с образованием вектора NYVAC∆B19R, либо двух генов — B19R и B8R, что приводило к образованию другого вектора — NYVAC-∆B8RB19R. Ген B8R кодировал интерферон-связывающий белок типа II. Удаление иммуномодулирующих генов поксвируса приводило к усилению иммунного ответа на гетерологичные антигены [39, 40].

Новый рекомбинантный вектор NYVAC-C-KC-∆B19R оценивался на безопасность при внутричерепном заражении новорожденных мышей. Результаты экспериментов показали, что он сохранил свой высокоаттенуированный фенотип, такой же как у родительского вируса осповакцины, штамм NYVAC. Оценка экспрессии встроенных генов env, gag, pol, nef ВИЧ клада С по сравнению с таковой родительского штамма, экспрессирующего те же антигены, показала увеличение эффективности экспрессии в культуре клеток кератиноцитов и дермальных фибробластов человека, что, видимо, обусловлено их способностью реплицироваться в этих клетках, тем самым увеличивая время экспрессии и большее накопление белка [37].

Сравнительная оценка иммунных ответов, индуцированных рекомбинантным репликативно-дефектным (родительским) вектором NYVAC с репликативно-компетентным NYVAC-C-KC, экспресссирующих одинаковые антигенные детерминанты ВИЧ-1 клада С, была проведена на макаках-резусах по схеме, примененной в испытании RV144. Праймирование в первой группе осуществлялось дважды рекомбинантным вектором NYVAC-C-KC, экспрессирующим трехмерную форму оболочечного белка gp140 (env, gp140) на 0-й и 4-й нед; бустирование — трижды рекомбинантным вектором NYVAC-C-KC, экспрессирующим gag-, pol-, и nef-антигены, с добавлением белкового компонента gp120 на 12-й, 24-й, 48-й нед. Во второй группе праймирование и бустирование осуществлялись рекомбинантными векторами на основе вектора NYVAC с теми же встроенными генами и по той же схеме [40].

Результаты иммунизации показали, что рекомбинанты на основе векторов NYVAC и NYVAC-C-KC индуцировали иммунные ответы. Однако иммунитет на основе вектора NYVAC-C-KC вызывал более сильные специфические Т-клеточный и гуморальный ответы.

Среди различных кандидатов в вакцины наиболее многообещающими представляются те, которые содержат высокоиммуногенные формы оболочечного белка в его нативной природной форме, которые будут индуцировать формирование Т- и В-клеточного иммунитета.

Применение схемы вакцинации праймирование/бустирование при использовании вакцин на основе рекомбинантных векторов NYVAC, экспрессирующих разные иммунодоминатные антигены ВИЧ-1 в трехмерной форме

В большинстве вакцин оболочечный белок представлен в мономерной форме, хотя нативные природные формы представляют собой трехмерные структуры. Этот факт обусловливает ограниченный успех. Он был отмечен при исследовании иммуногенности вакцин на основе вируса осповакцины, штамм MVA [41]. Сравнение результатов иммунизации ДНК, экспрессирующей белок gp120 в трехмерной форме, с иммунизацией ДНК, экспрессирующей белок gp120 в мономерной форме, в качестве праймирующих компонентов и бустирования рекомбинантным вектором MVA, экспрессирующим ВИЧ-1 gp120-, gag-, pol-, nef-антигены клада В, показало, что праймирующая иммунизация плазмидной ДНК, содержащей белок gp120 в трехмерной форме, при одинаковых условиях бустирования индуцирует более выраженный CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточный иммунный ответ, иммунную память и высокий титр антител против gp120 класса IgG2a и IgG3 [41].

Модификация векторов NYVAC осуществлялась таким образом, что встроенные гены экспрессировали белки также в трехмерной форме. Влияние встраивания генов, экспрессирующих белки в трехмерной форме, показано на двух новых векторах NYVAC, экспрессирующих оболочечный белок gp140 ВИЧ-1 клада С в трехмерной форме (NYVAC-140) и Gag-Pol-Nef (NYVAC Gag-Pol-Nef), как полипротеин, который образовывал вирусоподобные частицы [42]. При изучении их вирусологических и иммунологических характеристик было показано, что встройка этих генов не влияла на способность рекомбинантов реплицироваться в клетках фибробластов куриных эмбрионов. Встроенные ВИЧ-гены были стабильными при множественных пассажах, и ВИЧ-антигены корректно экспрессировались и высвобождались из клеток. Оба вируса запускали увеличенный по сравнению с ранее описанными рекомбинантными NYVAC специфический природный и активировали Т-клеточный (CD4-специфический оболочечный и CD8-Gag-специфический) и В-клеточный иммунные ответы и проявляли аттенуированный профиль у иммунокомпромиссных взрослых BALB/c и новорожденных мышей CD1 при внутримозговом введении.

Заключение

Таким образом, проведение экспериментов по оценке рекомбинантных вакцин на основе вируса осповакцины, штамм NYVAC, показало, что он может применяться как праймирующий и бустирующий вектор, причем при двукратном праймировании и бустировании. Встроенные гены можно изменить таким образом, что при экспрессии они нарабатывают белки в их природной трехмерной форме. Модификация родительского вируса осповакцины, штамм NYVAC, за счет встраивания ранее делетированных генов — K1L и C7L — привела к их способности реплицироваться в клетках ретикулоцитов и дермальных фибробластов человека. Делеция гена B19R, который кодировал интерферон-связывающий белок типа I, не только восстанавливала интерферон-сигнальные пути, но также активировала природный адаптивный иммунный ответ. Полученный новый вектор NYVAC-C-KC-∆B19R индуцировал более сильный иммунный ответ против антигенов ВИЧ-1 за счет увеличения их количества при удлинении времени трансмиссии вируса в клетках человека. Поэтому замена ALVAC на NYVAC в схемах, аналогичных RV144, может повысить эффективность вакцинации против ВИЧ-инфекции. NYVAC является перспективным вектором для разработки вакцин против ВИЧ, особенно в комбинации с ДНК-вакцинами. Его модификации (восстановление репликации в человеческих клетках, делеция иммуносупрессорных генов) позволяют усилить иммуногенность. Дальнейшие исследования должны быть направлены на оптимизацию схем вакцинации и тестирование новых конструкций в клинических испытаниях.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследования выполнены, рукопись подготовлена и публикуется за счет финансирования по месту работы авторов.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

Участие авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMIE. Л.Ф. Стовба — формирование концепции статьи, сбор и анализ данных научной литературы по проблематике, написание текста рукописи; А.А. Петров — анализ данных научной литературы по проблематике и переработка текста рукописи; О.В. Чухраля — составление таблиц; Д.И. Павельев— обоснование актуальности статьи, критический пересмотр и коррекция текста рукописи; С.А. Мельников— редактирование текста рукописи; С.В. Борисевич — сбор и анализ научной литературы, окончательное утверждение рукописи для публикации Все авторы статьи внесли существенный вклад в организацию и проведение исследования, прочли и одобрили окончательную версию рукописи перед публикацией.

About the authors

Lyudmila F. Stovba

48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-7985-5516

PhD in Biology

Russian Federation, 11 Oktyabrskaya str., 141306, Sergiev Posad, Moscow Region

Alexandr А. Petrov

48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-9714-2085

MD, PhD

Russian Federation, 11 Oktyabrskaya str., 141306, Sergiev Posad, Moscow Region

Oleg V. Chukhralia

48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-2603-0860
Russian Federation, 11 Oktyabrskaya str., 141306, Sergiev Posad, Moscow Region

Dmitriy I. Paveliev

48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: dpavelev@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-3204-1897
SPIN-code: 1443-5000
Russian Federation, 11 Oktyabrskaya str., 141306, Sergiev Posad, Moscow Region

Sergey A. Melnikov

48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: 48cnii@mil.ru

PhD in Biology

Russian Federation, 11 Oktyabrskaya str., 141306, Sergiev Posad, Moscow Region

Sergey V. Borisevich

48 Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6742-3919
SPIN-code: 5753-3400

MD, PhD, Professor, Academician of RAS

Russian Federation, 11 Oktyabrskaya str., 141306, Sergiev Posad, Moscow Region

References

Supplementary files